新疆哈萨克族原发性高血压与胱硫醚-β-合成酶T833C基因多态性的相关性

张 颖 张向阳 陈玉岚 欧阳菊艳 王 瑜 王 玲 王 红

(新疆医科大学第一附属医院干部病房，新疆 乌鲁木齐 830011)

原发性高血压是多因素多基因疾病，目前发病机制仍未阐明。其中血浆同型半胱氨酸(Hcy)增高已被普遍认为是心血管疾病的危险因素，并且可能参与了高血压的病理生理过程〔1〕。胱硫醚β-合成酶(CBS)是Hcy代谢途径中的关键酶之一，其基因突变可导致CBS活性明显降低，从而引起高同型半胱氨酸血症。CBS T833C是其较常见的多态性位点，但近年来关于该位点研究主要集中于脑血管疾病领域〔2〕，而与高血压的关系研究较少，与新疆哈萨克族原发性高血压关系的研究鲜有报道。本研究通过新疆哈萨克族原发性高血压患者及同族血压正常人群之间CBS T833C基因多态性分布的比较，探讨CBST833C基因多态性与新疆哈萨克族原发性高血压间的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 见表1。采用随机整群抽样的方法抽取定居在新疆塔城、伊犁、阿勒泰地区的哈萨克族人群，共纳入对象245例，进行标准化问卷调查，体格检查。各组受试者均无血缘关系，实验符合国务院颁布的《医疗机构管理条例》第33条规定，所有研究对象均了解实验目的和内容，签署知情同意书。其中高血压组共145例，男109例，女36例。纳入标准:高血压符合2010年中国高血压防治指南制订的高血压诊断标准〔3〕，收缩压(SBP)≥140 mmHg和(或)舒张压(DBP)≥90 mmHg。排除标准:排除继发性高血压，严重心律失常、冠心病，合并肝、肾功能不全，心力衰竭，脑血管意外者，肿瘤，急、慢性传染病，孕妇及哺乳期妇女的患者。对照组100例，男77例，女23例。纳入标准:同一地区的血压正常者，SBP＜140 mmHg和(或)DBP＜90 mmHg。排除标准:目前正在服降压药物且血压正常者;合并心脑肝肾疾病及急慢性疾病等其他疾病患者。高血压组与对照组受试者的性别与年龄匹配。高血压组的吸烟比例、体质量指数(BMI)、SBP、DBP、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及Hcy水平均明显高于对照组(P＜0.05)。而饮酒比例、血尿酸(UA)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平两组之间未见明显差异(P＞0.05)。

表1 高血压组与对照组一般临床资料比较(s)

表1 高血压组与对照组一般临床资料比较(s)

项目 高血压组(n=145)对照组(n=100)t/χ2 值 P值109/36 77/23 0.11 0.74年龄(岁)49.23±7.56 49.90±10.01 0.56 0.57吸烟〔n(%)〕 104(71.7)85(85)5.92 0.02饮酒〔n(%)〕 112(77.2)66(66)3.76 0.05 BMI(kg/m2)27.31±3.94 24.98±3.28 4.84 0.00 SBP(mmHg)161.18±23.62 120.92±11.85 15.72 0.00 DBP(mmHg)96.46±10.99 76.91±7.94 15.25 0.00 FPG(mmol/L)5.56±1.67 5.83±1.17 2.06 0.04 UA(mmol/L)294.69±59.20 282.27±34.87 1.88 0.06 TC(mmol/L)4.48±0.98 3.72±1.25 5.35 0.00 TG(mmol/L)3.38±1.54 2.69±1.53 3.50 0.01 HDL-C(mmol/L)1.21±0.33 1.19±0.24 0.04 0.97 LDL-C(mmol/L)2.73±0.65 2.10±0.58 7.85 0.00 Hcy(μmol/L)男/女(n)17.19±6.11 13.77±5.66 4.24 0.00

1.2方法

1.2.1血浆Hcy测定 清晨空腹采集外周静脉血3 ml，置EDTA-Na抗凝管，60 min内3 000 r/min离心10 min，分离血浆－80℃保存备测。采用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测，检测仪为伯乐酶标仪550型。

1.2.2其他生化指标测定 采用全自动生化分析仪酶法测定血浆FPG、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C及 UA水平。

1.2.3DNA提取及PCR扩增 采空腹血6 ml，EDTA抗凝。常规方法抽提基因组DNA，测定DNA含量和纯度。CBS T833C基因引物由上海生物工程公司合成，引物序列参考相关文献〔4〕。上游纯合型(P1):5'GGAGAAGTGTCCTGGATGCA3'，下游野生型(P2):5'CCCTTCGGGATCCACCCCAA3'，突变型(P3):5'CCCTTCGGGATCCACCCCAG3'。

PCR反应分两管进行，首先于第一管中加入P1和P2各0.5 μl;于第2管中加入P1和P3各0.5 μl，然后分别在2管中依次加入 2 × PCR Master 10 μl，DNA 模板 1 μl，ddH2O 8 μl，PCR反应总体系为20 μl。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性60 s，60℃复性45 s，72℃延伸60 s，35 个循环后72℃延伸7 min，4℃终止反应。特异性 PCR扩增产物片段大小为867 bp，20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果。

1.3统计学分析 采用 SPSS17.0统计软件行t检验及χ2检验，计算各组等位基因频率，并按Hardy-Weinberg平衡法检验样本的群体代表性。Logistic多元回归法分析基因多态性及其危险因素对疾病表型的作用。

2结果

2.1新疆哈萨克族CBS T833C基因型鉴定 酶切后存在3种基因型，纯合子TT显示867 bp 1号一条带而1'号没有条带，变异纯合子CC基因型显示867bp 2'号一条带而2号没有条带，杂合子TC基因型显示867 bp 3号及3'号两条带。见图1。

图1 CBS T833C基因多态性琼脂糖凝胶电泳图

2.2新疆哈萨克族CBS T833C基因型及等位基因频率进行定律检验 CBS T833C基因型TT、TC、CC分布频率观察值分别为49.80%(122例)、38.37%(94例)、11.83%(29例)，T等位基因频率为68.98%，C等位基因频率为31.02%。经Hardy-Weinberg平衡检验(χ2=2.62，P=0.11)，达到遗传平衡，在遗传学上具有群体代表性，可代表新疆哈萨克族人群。

2.3两组CBS T833C基因型与等位基因频率比较 两组研究对象在三种基因型分布及等位基因频率之间相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 高血压组与对照组CBS T833C多态性基因型及等位基因分布情况(n)

2.4哈萨克族CBS T833C不同基因型之间各临床指标比较CBS T833C各基因型之间在BMI及TG有统计学差异(P＜0.05)。其中CBS 833CC型在BMI指标中高于其他两型(P＜0.05)，CBS 833TC型在 TG指标中低于他两型(P＜0.05)。Hcy在CBS T833C不同基因型水平，经方差分析后差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 哈萨克族CBS T833C不同基因型各指标的比较(s)

表3 哈萨克族CBS T833C不同基因型各指标的比较(s)

25.58±3.39 26.73±4.12 28.19±4.07 6.85 0.00 SBP(mmHg)145.57±27.78144.62±28.60142.06±27.25 0.21 0.82 DBP(mmHg)88.43±13.35 89.14±14.40 86.88±13.83 0.33 0.72 FPG(mmol/L)5.65±0.88 5.80±1.21 5.79±0.76 0.66 0.51 UA(mmol/L)288.87±39.05295.29±67.09276.97±35.65 1.59 0.21 TC(mmol/L)4.02±1.20 4.32±1.16 4.29±0.95 1.97 0.14 TG(mmol/L)3.08±1.28 2.43±1.43 b 3.34±1.28 9.19 0.00 HDL-C(mmol/L)1.18±0.31 1.19±0.32 1.04±0.27 1.69 0.19 LDL-C(mmol/L)2.43±0.65 2.56±0.73 2.44±0.75 0.93 0.39 Hcy(μmol/L)BMI(kg/m2)16.31±6.70 15.36±5.73 15.82±6.32 0.32 0.72

2.5多元Logistic回归分析 以高血压分类为因变量，选择年龄、性别、高血压家族史、吸烟史、饮酒史、BMI、FPG、TG、TC、LDL-C、Hcy、T833C多态位点的基因型为自变量进行高血压危险因素回归分析，BMI(OR=1.21，95%CI 1.11～1.33，P=0.00)，Hcy(OR=1.08，95%CI1.03～1.14，P=0.00)及高血压家族史(OR=6.22，95%CI 3.31～11.68，P=0.00)是高血压的独立危险因素，CBS T833C多态位点基因型、年龄、吸烟史、饮酒史、FPG、TG、TC、LDL-C不是高血压的独立危险因素。

3讨论

全国高血压抽样调查显示新疆哈萨克族人群中高血压的患病率居全国前列〔5〕。近年来关于哈萨克族高血压的流行病学及遗传学研究日益增多。Hcy是心脑血管疾病发生的独立危险因素〔6〕，它可以造成血管内皮损伤，血管平滑肌增生〔7，8〕。以往流行病学研究中发现我国人群Hcy水平偏高，高血压患者则进一步升高〔9〕。本研究结果显示新疆哈萨克族高血压组患者的吸烟比例、BMI、SBP、DBP、TG、TC、FBG、LDL-C 及Hcy水平水平均明显高于同族血压正常对照组，说明对于该族高血压人群也应重视心血管危险因素的控制。

Hcy是甲硫氨酸代谢过程中的中间产物。在人体内Hcy的转归其中一条途径就是在CBS的催化下，Hcy转化成胱硫醚，是Hcy代谢途径的主要限速酶之一。CBS基因定位于21q22.3，目前发现CBS的突变位点多达132个，最常见位点为T833C。Kozich等〔10〕发现CBS基因外显子8中存在T833C突变，使得编码的苏氨酸被异亮氨酸替代，致CBS活性降低，从而造成Hcy在血中蓄积。本研究检测到新疆哈萨克族人群CBS T833C的三个基因型，但其等位基因的频率低于我国其他少数民族〔11〕。同时本研究对新疆哈萨克族高血压组及正常对照的CBS T833C基因型与等位基因频率进行比较，未发现两组研究对象在三种基因型的分布频率及等位基因频率之间的差异。

目前CBS T833C位点突变主要集中于脑血管领域〔12，13〕。Ding等〔14〕一项关于CBS基因多态性与中国人缺血性脑卒中关系的Meta分析指出CBS T833C基因多态性与缺血性脑卒中发病相关，同时携带C基因型是缺血性脑卒中的重要危险因素。而与高血压关系的研究国内尚无明确定论。呼日勒等〔15〕研究发现CBS基因T833C位点与蒙古族高血压病和高血压合并脑梗死无关。本研究结果提示Hcy的代谢除与CBS的代谢途径有关外，可能与年龄、TG、LDL基线水平及吸烟的差别有关。另外国内关于原发性高血压及同型半胱氨酸代谢基因多态性研究多集中在MTHFR C677T基因多态性，并且宗永华等〔16〕研究发现高血压人群中MTHFR基因 C677T纯合突变可能是Hcy升高和H型高血压的重要遗传因素，而且存在性别差异。但既往有关新疆哈萨克族原发性高血压与Hcy代谢基因多态性的研究中均未发现相关性〔17～19〕。本次研究也未发现CBS T833C位点突变与新疆哈萨克族原发性高血压有关，进一步说明Hcy代谢途径较为复杂，参与的主要代谢酶之间也可能存在某种联系。因此有关CBS基因变异与高血压的关系有待进一步研究。

1 Marosi K，Agota A，Végh V，et al.The role of homocysteine and methylenetetrahydrofolate reductase，methionine synthase，methionine synthase reductase polymorphisms in the development of cardiovascular diseases and hypertension〔J〕.Orv Hetil，2012;153(12):445-53.

2 吕雅丽，李俊枝，米明仁，等.CBS基因多态性与中国人缺血性脑卒中关系的Meta分析〔J〕.中国循证医学杂志，2010;10(6):674-7.

3 中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南:2010修订版〔J〕.中华高血压杂志，2011;19(8):701-43.

4 Pepe G，Vanegas OC，Rickards O，et al.World distribution of the T833 C/844 INS 68 CBS in cis double mutation:a reliable anthropological marker〔J〕.Hum Genet，1999;104(2):126-9.

5 全国高血压抽样调查协作组.中国高血压的患病率及其变化趋势〔J〕.中国高血压杂志，1995;1(增刊):7-13.

6 Malinowska A，Chmurzynska A.Polymorphism of genes encoding homocysteine metabolism-related enzymes and risk for cardiovascular disease〔J〕.Nutr Res，2009;29(10):685-95.

7 Bettowski J，Jamroz-Wisniewska A，Tokarzewska D.Hydrogen sulfide and its modulation in arterial hypertension and atherosclerosis〔J〕.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2010;1;8(4):173-86.

8 Tyagi N，Qipshidze N，Sen U，et al.Cystathionine beta synthase gene dose dependent vascular remodeling in murine model of hyperhomocysteinemia〔J〕.Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2011;33(3):210-22.

9 Hao L，Ma J，Zhu J，et al.High prevalence of hyperhomocysteinemia in Chinese adults is associated with low folate，vitamin B-12，and vitamin B-6 status〔J〕.J Nutr，2007;137(2):407-13.

10 Kozich V，Kraus JP.Screening for mutations by expressing patient cDNA segments in E Coli:homocystinuria due to cystathionineβ-synthase deficiency〔J〕.Hum Mutat，1992;1(2):113-23.

11 朱慧萍，赵如冰，刀京晶，等.中国北方少数民族人群同型半胱氨酸代谢酶的遗传多态性〔J〕.中国优生优育，2000;11(2):51-3.

12 Carnicer R，Navarro MA，Arbonés-Mainar JM，et al.Genetically based hypertension generated through interaction of mild hypoalphalipoproteinemia and mild hyperhomocysteinemia〔J〕.J Hypertens，2007;25(8):1597-607.

13 Grobelny BT，Ducruet AF，Derosa PA，et al.Gain-of-function polymorphisms of cystathionine β-synthase and delayed cerebral ischemia following aneurysmal subarachnoid hemorrhage〔J〕.J Neurosurg，2011;115(1):101-7.

14 Ding R，Lin S，Chen D.The association of Cystathionine β Synthase(CBS)T833C polymorphism and the risk of stroke:A meta-analysis〔J〕.J Neurol Sci，2012;312(1-2):26-30.

15 呼日勒，牛广明，赵世刚，等.胱硫醚β合酶(CBS)基因多态性与蒙古族人群原发性高血压及高血压合并脑梗死的关系〔J〕.临床荟萃，2006;21(21):1546-7.

16 宗永华，李小鹰，陈光亮，等.同型半胱氨酸水平与N5，10－亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的关系〔J〕.临床心血管病杂志，2011;27(3):203-7.

17 王 红，武贵臻，张 颖，等.新疆哈萨克族人群同型半胱氨酸及其代谢酶基因多态性与原发性高血压的关系〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2010;33(14):6247-52.

18 王 红，张 颖，张向阳，等.同型半胱氨酸及甲硫氨酸合酶A2756G基因多态性与新疆哈萨克族原发性高血压关系〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志，2010;24(9):879-82.

19 张 颖，王 红，张向阳，等.同型半胱氨酸及亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性与新疆哈萨克族原发性高血压的关系〔J〕.临床心血管病杂志，2012;28(8):570-3.