负性情绪应激大鼠模型的建立与评价

王慧霞 詹向红 李 伟 刘胜利 王有杰 于华林 伍盼盼 孙前明 潘玉颖

(河南中医学院，河南 郑州 450008)

伴随社会应激事件频频发生，人们感受到越来越多的紧张，由此引发的情绪问题也日益增多，情绪冲突已成为多种疾病发病率升高的重要原因之一，并在引起老年相关疾病的过程中起重要作用。国外报道显示经常遭受负性情绪应激的个体记忆力更易减退〔1〕，本课题组前期研究结果也显示，单一愤怒情绪可加速脑老化〔2〕。然而，有学者〔3〕对情志病患者研究发现，两种或两种以上负性情绪共同致病者占全部病例的88.97%，即多情交织共同致病更为常见。那么，多种负性情绪长期积累对脑老化进程会产生怎样的影响，其机制如何?本课题以负性情绪为切入点，试图建立负性情绪应激大鼠模型，为情绪应激动物模型的研制开拓新思路，并为情志内伤理论增添新的认识。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 Wistar大鼠70只，SPF级3月龄，雌雄各35只，雄鼠体重(360±10)g，雌鼠体重(300±10)g，购于山东鲁抗公司(SCXK(鲁)2013-0001)。在河南省中医药研究院动物实验中心IVC环境动物实验室(SYXK(豫)2012-0009)进行实验，并由该实验室提供标准实验动物灭菌垫料。所有的实验过程经河南中医学院动物伦理委员会批准进行。正常饲养1 w后，按体重和旷场实验得分，剔除结果偏离大的个体，余下的大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、D-半乳糖(D-gal)衰老及脑老化组(D-gal组)、负性情绪应激组(应激组)、D-gal+负性情绪应激组(应激D-gal组)，每组14只，雌雄各半，其余作为攻击鼠。各组雌雄分笼饲养，自由饮食饮水。

1.1.2主要实验仪器及试剂 旷场实验箱(上海欣软信息科技有限公司);Smart视频图像跟踪分析系统(Media Cybernetics.Inc);Nikon单反数码摄像机(日本尼康);PK-DS-112U频闪仪(上海临宜电气设备有限公司);HY-2调速多用振荡器(金坛市金城国胜实验仪器厂);AES-340大鼠饮水冲突实验系统(宁波市科技园区安来软件科技有限公司);TDCG接触式调压器(金坛市环宇科学仪器厂);全波长自动酶标分析仪、1575自动酶标洗板机(美国Thermo Scientific公司);大鼠血浆NE酶免试剂盒、5-羟色胺(5-HT)酶免试剂盒(美国R＆D公司，批号:14-02);大鼠血浆多巴胺(DA)酶免试剂盒(美国R＆D公司，批号:13-12);D-gal(美国 Amresco公司，批号:20130806);生理盐水(竹林众生制药厂，批号:20130915);蔗糖(北京化学试剂公司，批号:20131106)。

1.2方法

1.2.1衰老模型复制 参考文献〔4〕方法:将大量的D-gal粉末溶于生理盐水，配制浓度为2%D-gal，并灭菌以备用。采用颈背部皮下多点注射，注射容量为1 ml/100 g，1次/d;空白对照组注射同等体积生理盐水，连续6 w。每周测1次体重，根据测得体重计算注射容量。

1.2.2负性情绪应激引入 采用不可预知性心理应激(CUMS)诱导方法，应激组、应激D-gal组分别接受28 d八种不同的应激，分别为束缚(6 h/d)、温水游泳(水桶高50 cm，直径30 cm，水深30 cm，温度为 23℃ ±0.5℃，15 min/d)、间接电击(电压 40 V，1 ～2 次/min，15 min/d)、摇晃(160 次/min，30 min/d)、强光(300闪光/min，5 h/d)、潮湿垫料(每 100 g垫料洒入 250 ml水，12 h/d)、噪声(90 dB，3 h/d)、惩罚性饮水(0.5 mA，10 min)，每天1种，随机出现。

1.2.3旷场实验 应激结束后，一个实验人员握住大鼠尾根部1/3处，小心放入旷场正中格，另一个实验人员电脑操作Smart视频跟踪系统，自动记录动物3 min的行为变化及得分:①水平得分:动物穿越底面方格(四爪均进入的方格计数);②垂直得分:直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁);③旷场实验得分=①+②。同时记录中央格停留时间、修饰次数、粪便粒数。实验过程中及时用酒精擦拭其运动轨迹，防止残留气味线索。

1.2.4糖水消耗实验 大鼠单笼饲养，实验前训练动物适应蔗糖水;第一个24 h，给予每只大鼠一瓶1%蔗糖水;第2天禁食禁水23 h，之后进行正式实验，即给予每只大鼠一瓶200 ml的1%蔗糖水，1 h后取走并用量筒称取剩余糖水量，计算应激前后每只动物的糖水消耗量〔5〕。

1.2.524 h摄食量测定 于应激前和应激结束后测量，早上8:00给每笼大鼠添加饲料200 g，选择颗粒较大的饲料，以防止饲料过小掉入鼠笼引起实验误差，次日8:00称量剩余饲料量，计算24 h各组大鼠摄食量〔6〕。

1.2.6标本采集与制备 实验第47天取材，按照0.3 ml/100 g注射10%水合氯醛进行麻醉，麻醉后经腹主动脉取血4～5 ml，装于含乙二胺四乙酸(EDTA)钠的抗凝管中，静置、离心，吸取上清液，－70℃保存，用于测定大鼠血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)、去甲肾上腺素(NE)、5-HT。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0软件，多组间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);组间两两比较，方差齐的资料采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett T3检验。

2结果

2.1大鼠的行为表现 应激前期，应激组和应激D-gal组大鼠精神紧张，毛发竖立，尖叫，个别大鼠与同伴打斗、撕咬;随着应激时间延长，大鼠毛发零乱，目光无神，笼内大鼠紧挨，头部蜷缩于身体中，饮水及摄食量明显减少，夜间时有细声尖叫。

2.2旷场实验结果 各组旷场实验基线得分无统计学差异(P＞0.05)。造模后，与空白对照组相比，应激组大鼠旷场实验水平得分、垂直得分及总分下降，中央格停留时间增加(P＜0.05)。见表1。

2.3糖水消耗量及24 h摄食量比较果 各组基线糖水消耗量及24 h摄食量无统计学差异(P＞0.05)，与空白对照组相比，应激组大鼠造模后糖水消耗量、24 h摄食量减少(P＜0.05)。见表2。

2.4生化指标检测结果 与空白对照组相比，应激组大鼠血浆ACTH、CORT、NE水平上升，5-HT水平下降(P＜0.05)。见表3。

表1 四组大鼠旷场实验得分比较(x ± s，n=14)

表2 四组大鼠造模前后糖水消耗量及24 h摄食量比较(x ± s，n=14)

表3 四组大鼠血浆ACTH、CORT、NE、5-HT水平比较(x ±s，ng/L，n=14)

3讨论

已有医家将七情学说类比于应激理论〔7〕，国外有研究报道显示〔8〕，有暴力和幼年虐待经历会增加人们产生抑郁症状的风险，负性应激事件与不良的健康状况相关〔9〕。这与中医由情志不畅引起的肝郁证有相通之处，两者共同阐述了在遭遇持续不良心理应激时，个体内部的心理及生理状态发生变化，并最终累积形成肝气郁结状态的过程。情绪心理学中，抑郁比其他情绪都更为强烈持久，任何负性情绪体验交织在心中长期积累并互相影响，最终会使机体处于压抑、抑郁状态中。

有学者〔10〕采用束缚、居住入侵〔11〕制作肝郁模型，但存在躯体应激及模型复制成功率低等缺点，且应激方法多为单一应激方式持续作用于动物。本实验发现，同一种刺激方式可使动物能预测到下一个刺激的产生并逃避，减弱应激模型复制效果，应激因子的不可预测性是动物逃避反应缺失的关键〔12〕。

慢性轻度CUMS模型能较成功地诱发出以抑郁为主的负性情绪，应激因子多样化且不可预测，能避免单一刺激引起的适应性，可应用于慢性心理应激的神经生物学和行为心理学研究，但其中的电击、禁水禁食对动物产生躯体应激。因此，筛选出间接电击、惩罚性饮水、噪声、强光、摇晃、潮湿垫料、温水游泳和束缚八种应激因子，建立一个新的CUMS的诱导方法，每种应激方式最大限度地减少了躯体应激成分，所产生的心理应激反应相对纯粹。应激时间的长短可使模型所产生的情绪反应类型不同，有文献报道证实，短时间的应激条件下动物产生的反应以焦虑为主，长时间的应激作用会使动物的抑郁成分显著增加〔13〕。本实验目的旨在研究长期负性情绪应激对D-gal大鼠的影响，因此在模型的制备方面侧重于将单一应激因子的作用时间适当延长。对于应激动物的选择，雄性动物容易受到社会等级等社会心理因素影响，而雌性动物较少感受到，雌性动物的生理条件对较弱的应激更为敏感，因此，基于雌雄动物的应激反应差异以及女性的高情绪障碍罹患率，有必要将性别因素纳入情绪应激动物模型的研究设计中，以均衡性别对实验结果产生的影响。

本文结果提示慢性负性情绪应激降低了大鼠的兴奋性和探究趋势及认知功能。应激组糖水消耗量减少，这与任利翔等〔14〕的研究结果一致。大鼠有嗜甜食的习惯，糖水消耗量下降反映出大鼠的“快感缺失”状态，这与人类在负性情绪状态下，对通常令人感到愉悦的事物缺乏愉快的情绪反应相似。应激组24 h摄食量减少，这与人类在负性情绪状态时表现的食欲下降等症状相符，该现象可能为大鼠受到各种应激因子作用致作息规律紊乱所致。

应激反应是指在应激源的刺激下，个体所产生的生理、心理及行为反应。在日常生活中，应激源多种多样，如社会环境、生活事件、自然灾害等。当各种应激源作用于人体时，机体会产生一系列以下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴为核心的神经内分泌反应，参与其中的激素包括促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、ACTH和糖皮质激素(GC)。HPA轴激活，下丘脑释放的CRH升高，CRH的高分泌促进了垂体ACTH水平上升，后者又作用于肾上腺皮质，引起GC水平升高，应激学说与中医七情理论接近〔15〕，长期应激导致抑郁可能是通过HPA轴功能持续亢进，皮质醇升高并激动糖皮质激素受体，最终破坏海马神经细胞，导致海马体积缩小而发生的〔16〕。中枢单胺类神经递质包括NE，5-HT，DA。NE与应激时情绪反应相关，是交感-肾上腺-髓质激活的主要指标，血浆NE水平可反映外周交感神经的功能。5-HT参与调节睡眠、情绪、记忆等行为，当机体受到各种心理应激时，大脑5-HT的合成和代谢产生变化，大量不同的受体系统相互协调介导5-HT参与情绪的抑制控制过程，因此5-HT及其受体功能失调与抑郁等精神疾患相关。DA参与调控运动、动机与奖赏、内分泌等过程，DA能系统更多地涉及愉悦等正性心理过程，传递愉悦、兴奋等信息。三类神经递质参与不同的系统，它们之间相互制约，相互协调以维持机体正常的情绪活动和记忆功能，在一定程度上血浆中单胺类神经递质的改变可以反映中枢单胺类神经递质的浓度变化。

应激组大鼠血浆ACTH、CORT、NE水平升高，可能是因为负性情绪应激状态下，大鼠的HPA轴和交感-肾上腺-髓质的激活使体内ACTH、CORT、NE大量释放入血，该结论印证了严灿等〔17〕的研究结果;另外，许多学者认为肝郁证是由5-HT功能低下所致〔18〕，由此可推断大鼠在应激之后的状态为肝郁证。

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