眼针与体针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质脑源性神经营养因子表达的影响

高 原 王 哲 于 丹 王 莹 井 欢 潘 茜 赵金茹 王守岩 关洪全

(辽宁中医药大学基础医学院病理学教研室，辽宁 沈阳 110847)

脑缺血再灌注损伤(CIRI)是缺血性脑卒中的主要病理机制，脑血流中断和再灌注使脑细胞产生损伤是一个快速的级联反应，病理级联反应的恶性循环导致机体处于持续的恶性应激刺激状态。急性缺血性脑卒中为临床常见病，其发病率、致残率及死亡率在全世界范围内占有很高的比例，成为当今世界医学主要的研究课题。近年来，在临床上针灸治疗该病已取得可喜的疗效〔1〕，包括眼针疗法、体针疗法、头针疗法等。临床传统治疗中风常用针刺曲池、足三里两穴。本研究观察眼针与体针对急性CIRI大鼠神经功能缺损评分及脑皮质脑源性神经营养因子(BDNF)表达变化的影响，旨在探讨两种疗法对CIRI效应的差异性，为眼针疗法自成诊疗体系提供相关依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 健康SD大鼠48只，雌雄不拘，体重(280±20)g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证编号:SCXK(京)2007-0001。适应性喂养1 w，自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22℃，相对湿度45%。将大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、眼针穴区组、眼针穴区外组与体针组六组，每组8只。

1.2模型制备与评价 参照文献〔2〕，模型组、眼针穴区组、眼针穴区外组与体针组均采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。模型成功标准:大鼠于缺血2 h后进行再灌注，再灌注后进行神经功能缺损评分，参照Zea Longa 5分制评分标准〔3〕:0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。假手术组术式同模型组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5～1 cm，其他同模型组。正常对照组未处理。

1.3眼针取穴及刺法 眼针穴区组取穴:用31号13 mm毫针，定位参照人体取穴方法〔4〕，取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺。于大鼠眶缘处，采用眶上横刺法，按照穴区定位线1→8的顺序，从该穴区定位线一端进针，横刺进针3 mm，到另一定位线，留针20 min，10 min时刮针1次，刮针5下。治疗时机:于脑缺血再灌注即刻及其取材前30 min分别进行眼针治疗2次。眼针穴区外组取穴:选择眼针同名穴区的外3 mm处为针刺部位，刺法与眼针穴区相同。

1.4体针取穴及刺法 体针组取穴:按照《中国兽医针灸学》的方法取穴，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位。取曲池穴(大鼠曲池穴位置为肘关节前外侧凹陷中，针法为直刺5 mm)及足三里穴(大鼠足三里穴位置为膝关节后外侧、腓骨小头下约5 mm处，针法为斜刺1 cm)。

1.5试剂 亲和纯化兔抗鼠BDNF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。BDNF引物由北京华大基因公司合成。

1.6Western印迹方法 于缺血再灌注3 h后对大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑皮质，按脑皮质净重:裂解液=1∶10的比例，加入相应体积的裂解液，pH值为7.5，将样品剪碎后匀浆、离心，上清即为总蛋白。等量的细胞蛋白提取物通过SDS-PAGE电泳分离，并转移到PVDF膜上。在室温下，PVDF膜在封闭缓冲液中封闭2 h，孵育一抗缓冲液(BDNF 1∶500)，4℃过夜。次日，室温下孵育HRP-标记的二抗缓冲液(1∶3 000)2 h。O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 显色。扫描仪扫描NC膜，分析结果。

1.7实时定量RT-PCR方法 采用Trizol试剂提取脑组织总RNA，应用Quant Reverse Transcriptase逆转录合成cDNA第一链。以适量cDNA为模板，以β-actin为内参照，PCR扩增BDNF基因片段，BDNF基因扩增产物大小为86 bp，β-actin基因扩增产物为132 bp。BDNF上游引物:5'ATGGGTTACACGAAGGA 3';BDNF下游引物:5'GCCCGAACATACGATT 3'。β-actin上游引物:5'CGTGCGTGACATTAAAGAG 3'，下游引物5'TTGCCGATAGTGATGACCT 3'。所有的产物，在 ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT值，以管家基因β-actin为内参，以扩增倍数作为比较的依据。

1.8统计学处理 采用SPSS11.5软件行单因素方差分析。

2结果

2.1神经功能缺损评分 正常对照组和假手术组无神经功能障碍表现，脑缺血再灌注3 h后模型组大鼠出现不同程度的神经功能障碍，如提尾时左侧前肢不能伸直，行走向对侧旋转或倾倒等，表明CIRI大鼠模型复制成功。与模型组比较，眼针穴区组和体针组大鼠神经功能缺损评分降低(P＜0.01)，但两组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);眼针穴区外组评分接近模型组，与眼针穴区组、体针组差异显著(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠CIRI 3 h后神经缺损评分(x ± s，n=8)

2.2CIRI 3 h后各组大鼠脑皮质BDNF蛋白的表达 采用Western印迹方法检测大鼠脑皮质BDNF蛋白，模型组大鼠脑皮质BDNF蛋白表达明显低于正常对照组和假手术组(P＜0.01)。与模型组比较，眼针穴区组、体针组和眼针穴区外组大鼠脑皮质BDNF蛋白表达均上调(P＜0.01)，但以眼针穴区组与体针组升高较明显，且两组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。眼针穴区外组大鼠脑皮质BDNF蛋白表达较眼针穴区组、体针组显著下调(P＜0.01)。见表2。

表2 各组大鼠CIRI 3 h后脑皮质BDNF蛋白及mRNA的表达(x ± s，n=8)

2.3CIRI 3 h后各组大鼠脑皮质BDNF mRNA的表达 实时定量RT-PCR方法检测脑皮质BDNF mRNA表达的结果显示，模型组大鼠脑皮质BDNF mRNA表达较正常对照组、假手术组显著减少(P＜0.01)。与模型组相比，眼针穴区组、体针组和眼针穴区外组大鼠脑皮质BDNF mRNA表达均升高(P＜0.01)，但以眼针穴区组与体针组升高较明显，且两组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。眼针穴区外组大鼠脑皮质BDNF mRNA表达较眼针穴区组、体针组显著降低(P＜0.01)。见表2。

3讨论

缺血性脑卒中主要是由于心、肝、脾、肾等脏腑阴阳失调，虚、火、风、痰、瘀互为影响，致使机体气血逆乱，脉络瘀阻而发病。眼针疗法是彭静山教授根据中医学“诸经皆属于目”以及在后世医家的“五轮”“八廓”理论基础上，结合“八卦”学说，按照八卦方位将眼眶四周分为等份的八个区，每个区代表一个卦位，即乾、坎、艮、震、巽、离、坤、兑;在八区的基础上再依据经络脏腑的联属关系配以脏腑穴区，总计十三穴区，即肺穴、大肠穴、肾穴、膀胱穴、上焦穴、肝穴、胆穴、中焦穴、心穴、小肠穴、脾穴、胃穴、下焦穴〔5〕。“观眼识证”即根据“五轮”或“八廓”上的白睛血络变化进行辨证，在此基础上，根据“诸经系五轮，八廓应脏腑”的思维，从上述八区中选取相应穴位进行针刺，从而达到“通经调气血”以防治疾病的效果。临床上体针治疗该病多采用“治痿独取阳明”的选穴原则，阳明经多气多血，主润宗筋，阳明虚则宗筋纵;阳明经腧穴既能灌其中土、荣养四肢，又可疏通经络、运行气血。宿宝贵等〔6〕发现电针曲池、足三里两穴能有效地减小脑梗死面积并可保护梗死边缘区神经细胞。同时，蔡玉颖等〔7〕研究显示电针曲池、足三里两穴能减轻CIRI的神经功能缺损症状。因此本实验中体针疗法选择了针刺曲池、足三里两穴，该疗法也是目前疗效最为显著、临床应用最为广泛的一种治疗急性缺血性脑卒中的方法。眼针与体针在改善CIRI方面的作用上是否存在着差异，至今尚无报道。因此，探讨和阐明眼针疗法与体针疗法对急性CIRI模型大鼠效应的差异性及其可能机制，为眼针疗法自成诊疗体系提供相关依据。

BDNF是神经营养因子家族重要成员之一，是由Barde等在1982年从猪脑中首先分离和纯化的神经生长因子。在中枢神经系统发育过程中，BDNF对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。BDNF广泛分布在脑中枢各个部位，包括大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑和小脑等。BDNF能促进神经元生存、延缓变性的自然死亡，参与脑缺血损伤的保护过程。Lee等〔8〕研究发现在缺血较敏感的CA1区，BDNF的免疫反应性和BDNF mRNA间存在长期的表达差异，BDNF的水平很快下降;而在缺血耐受的齿状回只存在较短暂的表达差异，且能维持BDNF的水平。林百喜等〔9〕采用大鼠大脑中动脉阻塞再灌流模型，应用免疫组织化学方法测定脑缺血后3 d、7 d以及30 d脑内BDNF蛋白的表达，发现BDNF主要表达于缺血组大鼠脑内皮质、海马、缺血灶周围等处。脑缺血后3 d，上述部位BDNF的表达增高，7 d后其表达水平继续增强达高峰，30 d后BDNF表达水平降低。阳性细胞主要表达于神经元，其中在7 d、30 d两个时间点上，两组阳性细胞计数比较差异有显著性，结果表明脑缺血后BDNF蛋白的表达呈时段性增高。这些结果都充分说明BDNF参与了CIRI的保护过程。

本实验结果表明眼针和体针均可改善CIRI动物的一般状态，而针刺眼针穴区外对急性CIRI动物的神经损伤无明显改善作用。同时发现，在CIRI 3 h后，眼针穴区组、体针组和眼针穴区外组大鼠脑皮质BDNF无论在转录水平还是在翻译水平均迅速上调，眼针穴区组和体针组结果升高尤为显著，表明眼针和体针均通过增强BDNF表达以延缓神经元的变性、坏死，增强其抗损伤的能力，两种针刺疗法可能通过相似的途径治疗急性CIRI。针刺眼针穴区外的大鼠脑皮质BDNF的含量也有所上调，但其结果远低于眼针穴区组和体针组，说明针刺眼针非穴区对BDNF表达也有轻微影响作用，但是与眼针、体针比较其作用较弱，且此BDNF表达的改变并不足以改善神经功能缺损症状。本实验结果进一步证实眼针影响急性CIRI模型的机制可能与上调脑皮质BDNF的表达，从而增强急性CIRI时对神经元的保护有关〔10，11〕。同时，本实验证明眼针与体针在改善急性CIRI的作用上比较相似，两种疗法可能均与上调脑皮质BDNF的表达，从而增强神经元的抗损伤能力有关。本实验结果提示，眼针疗法与体针疗法的效果相近，但眼针疗法因其取穴少，安全方便，易于掌握，在临床中越来越受到人们的重视。

1 董振华，方剑乔，邵晓梅.针灸防治缺血再灌注损伤机制的研究进展〔J〕.上海针灸杂志，2011;30(12):877-80.

2 马贤德，孙宏伟，柴纪严，等.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中华中医药学刊，2009;27(6):1200-1.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

4 彭静山.眼针疗法〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社，1990:11.

5 董文毅，彭 敏.眼针疗法的研究进展〔J〕.针灸学报，1991;7(3):48-51.

6 宿宝贵，潘三强，吕来清，等.电针刺激“曲池”和“足三里”对大鼠脑梗死影响的形态学观察〔J〕.解剖学报，2005;36(4):403-6.

7 蔡玉颖，刘志顺，王 顺，等.电针曲池、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损的影响〔J〕.上海中医药大学学报，2009;23(6):64-6.

8 Lee TH，Kato H，Chen ST，et al.Expression disparity of brain derived neurotrophic factor immunoreactivity and mRNA in ischemic hippocampal neurons〔J〕.Neuroreport，2002;13(17):2271-5.

9 林百喜，谢 明，武 衡.大脑中动脉阻塞大鼠脑内脑源性神经营养因子蛋白表达变化〔J〕.中国现代医学杂志，2008;18(6):702-5.

10 王 哲，王德山，王 莹，等.眼针对急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织脑源性神经因子表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(22):4368-70.

11 王 哲，王守岩，王德山，等.眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织BDNF表达影响〔J〕.针灸临床杂志，2011;27(7):57-60.