抗菌中草药紫草的GC－MS分析

崔 锦，陈杰桃，穆 青

（复旦大学 药学院，上海 201203）

新疆紫草（Arnebia euchroma（Royle）Johnst.）是中药紫草的主要来源之一，又名软紫草，为紫草科（Boraginaceae）软紫草属多年生草本植物.紫草是我国常用中药材，有清热凉血、活血、解毒透疹之功效.用于血热毒盛、麻疹不透、疮痈肿毒、湿疹、水火烫伤等［1］.目前已从新疆紫草中分离到几大类化合物［2－7］，包括萘醌类、苯酚和苯醌类、吡咯里西啶生物碱类、多酚酸类、三萜酸类和酸性多糖等，其中萘醌类化合物因表现出多种重要的药理活性而被人们广泛关注［8］.现代药理研究表明，紫草具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、治疗烧伤［9－12］、抗生育、抑制前列腺素生物合成、降血糖、肝保护和抗HIV［13］等多种作用［14－15］.

随着抗生素在临床上的广泛应用，细菌对药物也产生了各式各样的耐药［16－20］.多药耐药金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是近年来医院内一种常见严重的传染病菌，已经对多种抗生素产生了耐药［21］.研究开发新类型、新机制的抗多药耐药金黄葡萄球菌药物的形势日趋紧迫［22］.

前期研究中我们以具有norA 外泵耐药基因的多药耐药金葡菌菌株SA1199B建立模型，对一些中草药进行了活性筛选.本文通过实验发现，新疆紫草根的95%乙醇提取物（AEC）及石油醚提取物（AEC01）对金黄色葡萄球菌耐药菌株显示出较好的抑制活性；对紫草乙醇粗提物进行了气相色谱－质谱联用（GCMS）分析，检测到了其中的萘醌类特征性成分.

1 实验部分

1.1 样品制备

紫草中药材于2009年购自上海华宇药业有限公司，经复旦大学生命科学院张文驹副教授鉴定为新疆紫草的根，凭证标本保存于复旦大学药学院天然药化教研室.样品粉碎（0.193mm），取100g分别用相应溶剂于45℃提取3次，第一次200mL，后两次分别100mL，45℃下减压回收溶剂，分别得到AEC（紫草乙醇提取物）、AEC01（紫草石油醚提取物）、AEC02（紫草乙酸乙酯提取物）、AEC03（紫草水溶性部位）.上述浸膏分别取所需量配制样品溶液用于化学分析和抗菌活性测定.

1.2 GC－MS分析条件

美国Thermo Focus DSQ 气相色谱－质谱联用仪；HP－5MS（30m×0.25mm×0.25μm）色谱柱.色谱条件：进样口温度250℃；起始温度60℃，保持2min；以15℃／min 升至300℃，保持5min；载气He；流速：1mL／min；进样方式：分流进样，分流比100∶1，进样量：0.2μL.质谱条件：电离方式EI，电离能量70eV，离子源温度250℃.传输线温度：250℃.扫描范围：41～400amu.质谱标准库：NIST 库.

1.3 抗耐药金葡菌活性测试

实验中涉及的6 种金黄色葡萄球菌分别为：ATCC25943（普通金黄色葡萄球菌）、SA1199B（具有NorA 外泵耐药基因的多药耐药菌株，它可将包括氟喹诺酮在内的多种抗生素排出细胞外）、Xu212（具有四环素外泵蛋白的耐四环素菌株）、RN4220（具有MsrA 氨基糖苷类外泵蛋白的耐氨基糖苷类菌株）、EMRSA15（耐林可霉素类抗生素）、EMRSA16（耐β－内酰胺类抗生素），英国伦敦大学药学院Simon Gibbons教授提供细菌并完成相关抑菌实验.

待测AEC系列样品溶液的配制：取相应样品用DMSO 配制成一定浓度溶液，用肉汤稀释成所需浓度.

最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）测定：测试前所有测试菌株接种于琼脂培养基（Oxoid）上于37℃培养24h.对照抗菌药物诺氟沙星（norfloxacin）和受试化合物样品AEC 系列样品溶液分别以一定浓度加入相应的孔槽中.基质为阳离子调节型肉汤（Cation Adjusted Mueller－Hinton Broth，CAMHB）.在37℃下培养18h.每一孔槽中加入5mg／mL的噻唑溴化四唑（MTT；Sigma）染色液20μL，培养20min.通过颜色从黄色到深蓝色变化判断细菌生长.根据MTT 显色结果，导致细菌无生长繁殖的最低药物或样品浓度为MIC值.

2 结果与讨论

2.1 活性测试

对新疆紫草不同极性的提取物进行活性测试，结果表明95%乙醇提取物及石油醚提取物对耐药金黄葡萄球菌具有显著抑制作用，MIC值分别为4～8μg／mL 和8～16μg／mL；乙酸乙酯和水提取部位均为128μg／mL（表1），即没有抗菌活性.

表1 紫草提取物以及不同极性部位的最低抑菌浓度Tab.1 The minimum inhibitory concentration of the ethanol extract and different polar parts fromA.euchroma

2.2 GC－MS分析

对抗菌活性最强的乙醇提取物AEC 进行了GC－MS 定性分析，总离子流图谱如图1 所示.运用replib，mainlib谱库对照，以峰面积归一化法计算各组分相对百分含量.样品AEC中鉴定出29个化合物，其中有4个特征性成分萘醌类化合物（共计27.69%），为5，8－二羟基－1，4－萘醌（0.76%）、去氧紫草素（17.49%）、乙酰紫草素（4.11%）和异戊酰紫草素（5.33%）.样品中存在大量脂肪烃和脂肪酸类脂质成分，共计67.62%.新疆紫草乙醇提取物GC－MS分析组分百分含量得到的结果如表2所示，其中主要的化学成分结构如图2所示.这一结果与我们以往对不同来源的紫草的成分分析结果［23］具有相似性.

新疆紫草乙醇提取物含有近50%的异戊酸、2－甲基丁酸和3－甲基巴豆酸.这类异戊烯类结构单元也出现在紫草特征性成分紫草萘醌化合物的烷基侧链中；相对含量较高（合计超过10%）的二十一烷（7.06%）和十七烷醇（5.04%）等长烷脂肪族化合物也出现在新疆紫草乙醇提取物中.从紫草的GC－MS可以看出，这种中药植物的生源代谢以乙酸－丙二酸及聚酮代谢途径为主.

图1 紫草乙醇提取物的总离子流图谱Fig.1 The total ion chromatogram of the ethanol extract fromA.euchroma

表2 新疆紫草乙醇提取物成分分析结果Tab.2 Analysis results of chemical constituent inthe ethanol extract fromA.euchroma

图2 新疆紫草乙醇提取物GC－MS检测到的主要化学成分的结构Fig.2 Structures of major compositions detected in the ethanol extract fromArnebia euchroma

新疆紫草95%乙醇提取物对耐药金黄葡萄球菌具有显著抑制作用，作为抗菌药物用途，紫草的乙醇提取物具有最强的抑菌效果.不同极性溶剂提取物中，仅石油醚部位具有较好的抗耐药菌活性，表明紫草抗菌活性物质为提取物中的低极性组分.根据上述样品的薄层色谱，发现活性组分AEC01的主要成分为紫草中特征性萘醌类衍生物，因此，我们推断萘醌类成分为紫草这一中药的抗菌物质基础，这一实验正在进行之中.

实验发现，紫草提取物抗菌活性并没有随着低极性物质在石油醚组分中的含量增加而增强，甚至有所降低.因此，我们推测可能存在一些大极性物质对低极性抗菌物质具有某种程度的协同增效作用，将在进一步的研究中分离紫草低极性和高极性萘醌类特征成分，并设计实验对这一推测进行验证.

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