水胡桃叶中萘醌的提取及其体外抗氧化活性

户恬，冯东，滕立，周革非，刘颂

烟台大学烟台大学生命科学学院（烟台 264005）

水胡桃（Pterocarya rhoifoliaSieb.et Zucc）为胡桃科（Juglandaceae），枫杨属（Pterocarya）植物，在我国主要分布于山东省境内[1]。经研究表明，该属植物含有多种化学成分[2-4]，具有抑制肿瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒等丰富的药理活性，其中萘醌类物质作为枫杨属植物主要活性物质之一，具有极强的抗氧化活性，可以延缓衰老[5]。试验探究水胡桃叶中萘醌类成分的最佳提取工艺，并对提取物体外抗氧化活性进行初步研究，以期为天然抗氧化剂的开发和枫杨属植物的利用提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

水胡桃叶样品（2021年5月采自山东莱阳，阴干后塑料袋封口保存）；DPPH（Sigma公司）；4, 8-二羟基-1-四氢萘醌标准品（实验室分离鉴定的单体化合物）；其他试剂均为国产分析纯。

TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线

精确称取0.002 0 g的4, 8-二羟基-1-四氢萘醌标准品，以无水乙醇定容，制作标准曲线[6]，并得到回归方程。

1.2.2 单因素试验

选取乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间4个单因素作为考察因素。乙醇体积分数分别为40%，50%，60%，70%和80%；料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（mg/mL）；提取温度分别为30，40，50，60和70 ℃；提取时间分别为3，4，5，6和7 h。在研究其中某一单因素变量的影响时，固定其他各因素条件：乙醇体积分数60%、料液比1∶30（mg/mL）、提取温度40 ℃、提取时间3 h。按照1.2.1所述方法，测定水胡桃叶中萘醌含量，平行试验3次，根据式（1）计算每次试验萘醌的提取量R（mg萘醌/g水胡桃叶粉）。

式中：c为提取液中萘醌质量浓度，mg/mL；v为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；m为水胡桃叶粉末质量，g。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验设计出四因素三水平的正交试验，以确定提取水胡桃叶中萘醌的最佳提取方案。正交因素水平表见表1。

表1 正交因素水平表

1.2.4 水胡桃叶萘醌类成分体外抗氧化活性试验

根据1.2.3试验结果，在确定的最优提取条件下，制备水胡桃叶萘醌提取液，减压浓缩至干。配制不同浓度的水胡桃叶萘醌提取液，以VC为对照测定其对DPPH·自由基[6-7]和·OH自由基[8-9]的清除率，并对其还原力进行测定[10]。各组试验重复3次，并利用式（2）计算水胡桃叶萘醌取液对各自由基清除率。

1.3 数据处理

单因素试验和体外抗氧化性试验数据均用“均数±标准差”表示；正交试验利用SPASS软件进行设计，数据处理和分析；数据显著性分析用F-检验法检验。

2 结果分析

2.1 标准曲线及方程

根据1.2.1所示方法，可得标准曲线方程y=10.370 0x-0.026 7，回归系数R2=0.999 7。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对萘醌提取量的影响

由图1可以看出，在乙醇分数低于6%时，萘醌提取量随乙醇体积分数的增大而增加，乙醇体积分数60%时，萘醌的提取量达到最高120.13 mg/g。但继续增大乙醇体积分数时，萘醌提取量降低。造成这种现象的原因可能是：在一定范围内，乙醇体积分数越大，溶剂极性越小，溶液与萘醌类成分极性越接近，根据相似相溶原理，溶剂极性小有利于水胡桃叶萘醌类化合物析出，提取量变大；乙醇体积分数继续增大，超过一定范围时，溶剂与萘醌极性差距变大，提取量减小。因此，提取水胡桃叶中萘醌的最佳乙醇体积分数为60%。

图1 乙醇体积分数对萘醌提取量的影响

2.2.2 料液比对萘醌提取量的影响

由图2可以看出，萘醌提取量随料液比中液体占比的增大而增加，但料液比1∶40（g/mL）后萘醌提取量增加幅度明显降低，造成这种现象的原因可能是：提取溶剂的量较少时，萘醌溶解量达到饱和，使得萘醌提取量较低，但当提取溶剂增加时萘醌溶解量增加，此时萘醌提取率逐渐增大。综合后续提取工艺各因素考虑，水胡桃叶中萘醌提取最佳料液比1∶40（g/mL），此时萘醌的提取量为136.6 mg/g。

图2 料液比对萘醌提取量的影响

2.2.3 提取温度对萘醌提取量的影响

由图3可以看出，在60 ℃之前萘醌提取量随提取温度的升高而增加，提取温度60 ℃时，萘醌的提取量达到最高153.92 mg/g。但随着提取温度继续上升，萘醌提取量降低。造成这种现象的原因可能是：在一定范围内，随着温度升高，萘醌的溶解度变大，提取量也随之增大；但温度过高时，乙醇挥发量增加，萘醌类成分也会因为温度升高发生化学变化，导致萘醌的提取量下降。因此，水胡桃叶中萘醌最佳提取温度为60 ℃。

图3 提取温度对萘醌提取量的影响

2.2.4 提取时间对萘醌提取量的影响

由图4可知，在6 h之前，随着提取时间的增加，萘醌提取量逐渐上升。提取时间6 h时，萘醌提取量达115.2 mg/g。但提取时间继续延长，萘醌提取量下降。造成这种现象的原因可能是：在提取时间较短的情况下，水胡桃叶中的萘醌类物质不能完全溶出，随着提取时间不断增加，水胡桃叶中萘醌类成分溶解在乙醇中的含量增加；但当达到一定时间后，溶出的萘醌已达到平衡，反而有可能因提取时间过长导致萘醌类物质水解，提取量下降。因此，水胡桃叶中萘醌最佳提取时间为6 h。

图4 提取时间对萘醌提取量的影响

2.3 正交试验分析结果

根据表2可知：4种因素对水胡桃叶中萘醌提取率的影响大小顺序为A＞D＞B＞C，即料液比＞乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度；醇提取法提取水胡桃叶中萘醌类成分最优的提取组合为A3B1C2D1，即以体积分数50%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比1∶50（g/mL），提取温度60 ℃，提取时间5 h，在此条件下，萘醌提取量可达168.14 mg/g。

表2 正交试验结果

表3 正交试验结果方差分析表

2.4 水胡桃叶萘醌类成分体外抗氧化活性测定结果

2.4.1 萘醌类成分清除DPPH·活性测定

由图5可知，随着样品质量浓度增大，水胡桃叶萘醌提取物及VC两者对DPPH·自由基清除能力逐渐增强。但水胡桃叶萘醌提取物及VC质量浓度大于0.6 mg/mL时，两者对DPPH·自由基的清除率逐渐趋于平稳。且水胡桃叶萘醌提取物对DPPH·自由基的清除能力弱于同浓度同体积的VC溶液。

图5 水胡桃叶萘醌类物质对DPPH·的清除效果

2.4.2 萘醌类成分清除·OH活性测定

由图6可知，水胡桃叶萘醌提取物及VC两者对·OH自由基的清除率在质量浓度0～0.6 mg/mL范围内，随着浓度的增大而逐渐增大。水胡桃叶萘醌提取物及VC质量浓度大于0.6 mg/mL时，虽然两者对·OH自由基的清除率仍然上升，但整体逐渐趋于平稳。且同浓度同体积的VC溶液对·OH自由基的清除能力优于水胡桃叶萘醌提取物。

图6 水胡桃叶萘醌类物质对·OH的清除效果

2.4.3 萘醌类成分还原力测定

萘醌能使反应体系中Fe3+还原成Fe2+，溶液由黄色变成不同程度的蓝色[11]。还原能力越强，吸光度越大。由图7可知，在一定浓度范围内，还原力随着水胡桃叶萘醌提取物及VC溶液质量浓度的增大而逐渐增强，表现出良好的还原能力。

图7 水胡桃叶萘醌类物质还原力测定结果

3 结论

试验对可能影响试验结果的4种因素进行研究与分析，通过单因素试验与正交试验结果分析得出：影响水胡桃叶中萘醌提取量的4种因素的影响程度为A＞D＞B＞C，即料液比＞乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度；萘醌最优提取工艺条件为提取溶剂采用体积分数50%乙醇，料液比1∶50（g/mL），提取温度60℃，提取时间5 h，该提取工艺条件下萘醌的提取量为168.14 mg/g。

通过对水胡桃叶萘醌提取物清除DPPH·、·OH的测定，并对其还原力进行测定，结果表明水胡桃叶萘醌类成分具有良好的体外抗氧化活性。随着社会的进步，医疗产业的发展及药物的开发越来越受到社会的关注和重视，其中天然产物的开发仍占有相当重要的地位。枫杨属植物活性多样，种类丰富，且生长速度快，具有潜在的药用价值[12]。试验结果可对枫杨属植物的研究提供一定价值参考，为天然植物中抗氧化剂的开发与应用提供理论依据。