DNA结合蛋白DbpA影响DNA聚合酶性能的研究

曹淑中，裘丽珍

（复旦大学 生命科学学院，上海 200438）

DNA 聚合酶是催化DNA 合成的酶，在体内和体外都具有重要作用：在体内，DNA 聚合酶参与DNA的复制和损伤修复；在体外，DNA 聚合酶是重要的工具酶，被应用于聚合酶链式反应（PCR）、DNA 测序等.最早发现的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ［1］，DNA 聚合酶的发现极大地推动了分子生物学的发展，促进了人们对DNA 复制和损伤修复以及DNA 转录及其调控机制的理解，而PCR 技术、DNA 测序技术是分子生物学必不可少的实验手段.

根据蛋白质序列和结构的相似性，DNA 聚合酶分为A、B、C、D、X、Y、RT 7个大家族.其中B型DNA聚合酶是与大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅱ同源的一类DNA 聚合酶，典型特征是具有3'－5'外切核酸酶活性和高保真性［2－3］.

PCR 技术是DNA 聚合酶的重要应用，经预变性、变性、退火、延伸、总延伸等步骤特异性扩增并得到大量目的DNA，为研究人员提供了一种简单有效地获取目的DNA 的方法［4］.许多PCR 衍生技术能满足不同实验的需求，如荧光实时定量PCR、组装PCR 等［5－6］.不同的DNA 聚合酶具有不同的性能，许多研究致力于寻找和改造得到更好的DNA 聚合酶，以简化实验操作和满足不同科研人员的需要.耐热性的Taq DNA 聚合酶的应用极大地简化了PCR 的操作步骤，使PCR 的自动化成为可能，同时也使PCR 技术真正得到推广［7］.对DNA 聚合酶改造得到的热启动DNA 聚合酶能有效地抑制非特异性扩增［8］.Taq DNA 聚合酶E708L及E708W 能提高其对血液和土壤中PCR 抑制物的抵抗能力［9］.

自PCR 技术问世，研究便发现PCR 扩增DNA 会导致产物DNA 序列的变化即引入突变，影响因素包括：DNA 聚合酶的保真性、PCR 循环数和PCR 的反应条件.针对引入突变的不同因素，减少DNA 产物突变的方法有：选用高保真性DNA 聚合酶、减少PCR 的循环数和选用合适的缓冲液体系［10］.其中，选用高保真性DNA 聚合酶是最优的方法，不降低PCR 循环数，不降低DNA 产量.

Pfu DNA 聚合酶因具有高保真性而被广泛应用，其具有3'－5'外切核酸酶活性，能校正PCR 过程中错配掺入的核苷酸，突变率为1×10－6，保真性是Taq DNA 聚合酶的8倍［11］.Pfu DNA 聚合酶的聚合酶活性和3'－5'外切核酸酶活性是功能相反的活性，二者的平衡体现在酶的延伸速度和保真性上［12］.Pfu DNA 聚合酶具有较强的3'－5'外切核酸酶活性，因此具有高保真性的优点，但同时其延伸速度仅为1～2min／kb，相较于Taq DNA 聚合酶的30～60s／kb慢很多.因此Pfu DNA 聚合酶的应用受到了一定的限制，研究提高其延伸速度将使其应用更加广泛，并为科研人员带来更多的便利.

Pfu DNA 聚合酶具有5个结构域，分别是手指结构域、手掌结构域、拇指结构域、外切核酸酶活性结构域和5'端结构域，各个结构域之间构象的变化导致酶活性的变化.Pfu DNA 聚合酶中存在一些关键位点，这些位点在酶活性调节起着重要作用.Pfu DNA 聚合酶外切核酸酶结构域中存在一个独特的保守性的环，环中H147E突变使核酸外切酶结构域负电增强，并吸引拇指结构域向其靠近，阻止了单链DNA 与外切核酸酶结构域的结合，从而导致了外切核酸酶活性的降低［13］.Pfu DNA 聚合酶同时具有一个高度保守的A 基序，影响酶的dNTP结合能力、动力学参数、保真性等，其中Y410V 比野生型表现出更高的保真性，但在底物浓度低时对dNTP的利用存在缺陷［14］.通过对关键位点进行突变能提高酶某些方面的性能，但却可能带来一些负面的效果.

DNA 聚合酶的持续合成能力是酶一次结合到DNA 模板上能催化延伸的核苷酸数目，是影响酶延伸速度的重要因素.DNA 聚合酶与模板DNA 的结合是酶催化DNA 复制的重要前提，DNA 聚合酶与双链DNA 结合区域的缺失导致酶持续合成能力的急剧下降，说明酶与双链DNA 结合的能力是影响酶持续合成能力的重要因素［15］.提高酶与双链DNA 结合能力能提高其持续合成能力和延伸速度.Pfu DNA 聚合酶与热稳定性的非特异性双链DNA 结合蛋白Sso7d融合表达能提高其持续合成能力及延伸速度.由于Sso7d分子质量小，只有7ku，融合表达后不影响Pfu DNA 聚合酶自身的热稳定性［16］.同时Sso7d不影响Pfu DNA 聚合酶自身的dNTP 掺入效率，也不影响保真性［17］.

Pfu DNA 聚合酶与Sso7d融合表达很好地提高了野生型Pfu DNA 聚合酶的性能，但双链DNA 结合蛋白提高DNA 聚合酶性能的普遍性未知，即其余双链DNA 结合蛋白能否提高Pfu DNA 聚合酶的性能未知.研究不同双链DNA 结合蛋白融合表达提高Pfu DNA 聚合酶的性能，将得到更优的Pfu DNA 聚合酶，同时增加对Pfu DNA 聚合酶改造机制的了解.按非特异性双链DNA 结合蛋白、热稳定、分子质量小3个条件筛选，得到来自古生菌Sulfolobus solfataricus的8ku大小的DbpA 蛋白，是提高Pfu DNA 聚合酶性能的一个很好的选项.本研究旨在了解DbpA 提高Pfu DNA 聚合酶性能的效果，增加对非特异性双链DNA 结合蛋白提高DNA 聚合酶性能的机制和普遍性的认识.

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、E.coli SURE2为本实验室保存菌株，pT7N10C6为本实验室保存载体.pET16b.Pfu和pSJS1240购自Addgene.实验所用限制性内切酶、Phusion DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、M13 单链DNA、λDNA 均购自NEB 公司.dNTP、D2000DNA marker、500bp DNA ladder等购自天根生化科技（北京）有限公司.镍柱购自赛默飞世尔科技公司.蛋白胨、酵母粉、氯化钠、抗生素等各种化学药品均购自生工生物工程（上海）股份有限公司.引物合成、DNA 测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 Pfu DNA 聚合酶基因及DbpA 基因的获取

根据Pfu DNA 聚合酶基因序列设计引物进行扩增，扩增产物CAATTG－Pfu－GGTACC－CTCGAG经MfeⅠ、XhoⅠ双酶切插入到载体pT7N10C6中.构建载体pT7N10C6－Pfu经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定正确后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序.

根据NCBI网站提供的DbpA（NP＿343206.1）蛋白质序列，进行密码子优化，得到长222bp的DNA序列信息.将DbpA 基因分成小于60nt的正链片段DbpA－1、DbpA－2、DbpA－3及两端的PCR 引物5'－GGTACC－DbpA 和DbpA－GAGCTC－3'，设计负链引物DbpA－Bridge－1、DbpA－bridge－2，分别与相邻两条正链互补并分别互补（图1）.将引物DbpA－1、DbpA－2、DbpA－3、DbpA－Bridge－1、DbpA－bridge－2（表1）混合再稀释100倍用作模板进行PCR 扩增，得到总长240bp的GGTACC－DbpA－CTCGAG，并经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切后插入到载体pT7N10C6－Pfu中，得到质粒pT7N10C6－Pfu－DbpA，该质粒经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后凝胶电泳鉴定并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序.

图1 DbpA 基因构建Fig.1 DbpAgene construction

表1 载体构建引物Tab.1 Primers designed for plasmids construction

1.2.2 蛋白质表达纯化

将构建好的pT7N10C6－Pfu和pT7N10C6－Pfu－DbpA 分别与pSJS1240共转E.coli BL21（DE3），分别诱导表达Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶.裂解细菌，12 000r／min离心，取上清80℃加热15min，再次离心，上清通过镍柱进行亲和纯化.纯化的Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶经SDS－PAGE 检测，并通过PCR 扩增（引物序列见表2）增强性绿色荧光蛋白（EGFP）验证其DNA 聚合酶活性.验证正确的Pfu DNA聚合酶添加等体积甘油并保存于－20℃.

表2 DNA聚合酶性能鉴定用引物Tab.2 Primers designed for character determination of DNA polymerase

1.2.3 内切酶污染检测

配置EGFP扩增反应体系并进行PCR 扩增，程序设置：95℃2min；95℃30s，72℃1min，循环30次；72℃5min；12℃保温.扩增产物EGFP放置于37℃培养箱，每隔24h取样并于4℃冰箱保存.凝胶电泳检测EGFP产物条带变化情况.

1.2.4 热稳定性实验

将Pfu DNA 聚合酶稀释到2×Pfu buffer中，分装成6管，编号1～6，每管10μL，1～6管分别95℃加热0，30，60，80，100，120min.配置dNTP、EGFP引物、模板、水反应混合液.取10μL 反应混合液加入到已加热的1～6号管中，混匀.6管同时在一台PCR 仪中进行PCR，程序设置：95℃2min；95℃30s，72℃1min，循环30次；72℃5min；12℃保温.PCR 产物全部上样进行凝胶电泳.

凝胶成像图在Image J中进行灰度分析，即读取各泳道PCR 产物的灰度值.以加热0min产物泳道的灰度值为1，计算其余各泳道的灰度百分比.作时间与灰度百分比的变化曲线.

1.2.5 延伸速度实验

配置EGFP扩增反应体系，分装成9管，编号1～9.PCR 程序设置：95℃预变性30s；56℃退火20s；72℃延伸，1～9管延伸时间依次是10，15，20，25，30，35，40，45，50s；12℃保温.PCR 产物全部上样进行凝胶电泳.

凝胶成像图在Image J中进行灰度分析，即读取各泳道PCR 产物的灰度值.以最后一个泳道的灰度值为1，算出前面各泳道的灰度百分比.作时间与灰度百分比的增长曲线.

1.2.6 荧光实时定量实验配置M13扩增反应体系，含2.5ng M13 单链DNA，Eva Green作为染料.反应体系置于实时荧光定量PCR 仪CFX96，程序设置：95℃2min；56℃20s；72℃5s，荧光读数，20个循环.

1.2.7 耐盐性实验

配置EGFP扩增反应体系，含2×Pfu buffer，分装成7管，编号1～7，再用不同浓度KCl溶液将2×Pfu buffer稀释成1×Pfu buffer，KCl终浓度依次是10，30，50，70，90，110，130mmol／L.7管同时在一台PCR 仪中进行PCR，程序设置：95℃2min；95℃30s，72℃1min，循环30次；72℃5min；12℃保温.PCR 产物全部上样进行凝胶电泳.

1.2.8 扩增效率实验

配置扩增反应体系，含50ngλDNA，不同引物分别用以扩增0.5，1，2，5，8，10，12，15kb的DNA 片段.所有反应体系同时在一台PCR 仪中进行PCR，PCR 程序设置：95℃20s；94℃5s，72℃1min，循环20次；72℃7min；12℃保温.PCR 产物全部上样进行凝胶电泳.

1.2.9 保真性实验

采用Pfu DNA 聚合酶、Pfu－DbpA DNA 聚合酶和Taq DNA 聚合酶扩增1.3kb的DNA 片段pLacmRFP.EcoRⅠ和PstⅠ酶切插入片段pLac－mRFP和载体pSB1AK3，凝胶电泳回收，16℃连接过夜，转化至SURE2感受态细胞，涂布于Amp抗性平板，37℃培养18h，4℃放置2h.计算平板上白色菌落占总菌落数的比例.同时利用Pfu DNA 聚合酶和Pfu－DbpA DNA 聚合酶扩增5kbλDNA 片段，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序.

2 结果与分析

2.1 DbpA 基因的获取与分析

Sulfolobus solfataricus是一类嗜高温古生菌，生长在火山喷泉中，具有嗜酸性和嗜热性.DbpA 是其细胞内含量丰富的一种非特异性双链DNA 结合蛋白，保护基因组DNA 免受高温强酸的影响和破坏.

因无法获得DbpA 基因的模板，本研究采用引物重叠延伸的方法扩增得到DbpA 基因，原理如图1所示.扩增得到的DbpA 序列经过酶切和连接后插入到pT7N10C6－Pfu中得到pT7N10C6－Pfu－DbpA，并经T7terminator引物测序验证正确.

2.2 蛋白质表达纯化结果与分析

Pfu DNA 聚合酶编码基因来自于古生菌Pyrococcus furiosus，因其使用了稀有密码子导致在大肠杆菌中无法表达.pSJS1240 携带argU 和ileX 基因，编码稀有密码子tRNA ARG 和tRNA ILE，与Pfu DNA 聚合酶编码基因共转E.coli BL21（DE3）能提高Pfu DNA 聚合酶的表达水平.

因纯化蛋白是DNA 聚合酶，所以将样品用于PCR 扩增EGFP，验证其酶活性.验证正确的Pfu DNA聚合酶在50%甘油中长期保存于－20℃.

2.3 内切酶污染检测结果与分析

DNA 聚合酶体外纯化并主要被用于PCR 扩增DNA，因此需要保证无内切酶污染.将纯化的Pfu DNA 聚合酶用于PCR 扩增EGFP，PCR 反应结束后反应体系直接置于37℃，每隔24h取样并4℃保存，凝胶电泳检测EGFP产物条带变化.如果存在内切酶污染，因随着酶切时间的延长限制性内切酶会出现星号活性任意切割DNA，EGFP DNA 的量随37℃放置的时间延长而减少甚至完全消失.

实验结果如图2所示，随着37℃放置时间的延长，EGFP条带的亮度不随37℃放置的时间延长而减弱，说明纯化的Pfu DNA 聚合酶中不存在限制性内切酶的污染.蛋白纯化过程中上清80 ℃加热15 min使非热稳定性的蛋白质变性失活，并在随后的离心中被去除.加之镍柱亲和纯化使本研究所用方法纯化得到的Pfu DNA 聚合酶不存在内切酶污染，并能安全可靠的应用于PCR.

图2 内切酶污染检测Fig.2 Endonuclease contamination determination

2.4 热稳定性结果与分析

将酶在2×缓冲液中95℃分别加热0，30，60，80，100，120min，再加入PCR 体系其余组分进行PCR扩增EGFP.根据EGFP扩增产物量的变化反应酶活性随加热时间的变化，即反应出酶的热稳定性.

Pfu DNA 聚合酶都具有很强的热稳定性，DbpA 的融合未改变Pfu DNA 聚合酶自身的热稳定性，Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶热稳定性无显著差异，如图3所示.

图3 Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶热稳定性比较Fig.3 Comparison of thermo stability of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.5 延伸速度结果与分析

逐步减少PCR 扩增反应体系的延伸时间，当延伸时间足够的情况下，改变延伸时间PCR 产物的量不变，但当延伸时间不足时，各循环的扩增产物延伸不充分，最终导致扩增产物量随延伸时间的减少而减少.PCR 总延伸将延伸不充分的产物全部延伸充分，需要去除这一步操作，消除对实验结果干扰.本研究设置了10，15，20，25，30，35，40，45，50s一系列延伸时间，PCR 扩增EGFP，产物全部进行凝胶电泳.结果如图4所示.对Pfu DNA 聚合酶，延伸时间45～50s能得到最大产物量，符合其延伸速度1kb／s，随着延伸时间的减少，EGFP产物量明显减少.如图4定量分析显示，对Pfu－DbpA DNA 聚合酶，EGFP 产物量随延伸时间的减少而减少的速度明显更慢.所以Pfu－DbpA DNA 聚合酶的延伸速度快于Pfu DNA 聚合酶.

图4 Pfu与Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度比较Fig.4 Extension rate Comparison of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.6 荧光实时定量结果与分析

M13ssDNA 是一种单链DNA，与引物结合之后延伸得到双链DNA.Eva Green是一种非特异性DNA结合染料，不与DNA 结合时不发射荧光信号，与DNA结合之后发射荧光信号.M13ssDNA 与引物退火后，只进行延伸步骤，与DNA 结合的Eva Green随延伸的进行而增多，荧光信号增强.通过CFX96监测荧光信号，信号增长速度反应酶的延伸速度.实验结果显示，Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度慢于Pfu DNA 聚合酶，如图5所示，与延伸速度结果不符（图4），可能是DbpA 融合表达得到的Pfu－DbpA DNA 聚合酶对Eva Green敏感导致.

图5 Pfu和Pfu－DbpADNA 聚合酶荧光实时数据结果Fig.5 Fluorescence real－time data of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.7 耐盐性结果与分析

盐离子强度影响酶与模板的结合，DNA 聚合酶的持续合成能力与耐盐性存在正相关性.低持续合成能力的DNA 聚合酶使用低盐浓度的缓冲液，高持续合成能力的DNA 聚合酶能使用高盐浓度的缓冲液.增加DNA 聚合酶的耐盐性使其能够在更广泛的缓冲液中使用.

配制EGFP扩增反应体系，逐步增加KCl浓度，PCR 扩增EGFP.Pfu DNA 聚合酶的KCl耐受性较低，而Pfu－DbpA DNA 聚合酶的KCl耐受性得到了较大的提高，如图6所示.因此，Pfu－DbpA DNA 聚合酶的持续合成能力高于Pfu DNA 聚合酶，同时结果暗示Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度快于Pfu DNA聚合酶.

2.8 扩增效率结果与分析

对DNA 聚合酶的改造，包括提高持续合成能力、延伸速度、保真性等，最终目的都是提高酶在实际应用中的性能表现.提高DNA 聚合酶的延伸速度使相同的延伸时间内扩增更长的DNA 片段，或者扩增相同的的DNA 片段花费更少的时间.本研究通过扩增0.5～15kbλDNA片段证明酶扩增效率的提升.PCR扩增程序延伸时间设为1min时，Pfu DNA 聚合酶能扩增出少量2kb的产物，而Pfu－DbpA DNA聚合酶能扩增出少量5kb的产物，如图7所示.而两种聚合酶均未能扩增出8，10，12，15kb的λDNA 片段（结果未图示）.实验结果说明Pfu－DbpA DNA聚合酶比Pfu DNA聚合酶具有更快的延伸速度，实际应用效果也更好.

图6 Pfu和Pfu－DbpADNA 聚合酶耐盐性比较Fig.6 Comparison of salt tolerance of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

图7 Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶扩增效率比较Fig.7 Comparison of PCR efficiency of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.9 保真性检测结果与分析

实验以Pfu DNA 聚合酶、Pfu－DbpA DNA 聚合酶和Taq DNA 聚合酶扩增插入片段pLac－mRFP，经酶切插入到载体，转化至E.coli SURE2感受态细胞.因SURE2感受态细胞内无Lac启动子的阻遏物LacⅠ，Lac启动子不需诱导即可启动mRFP基因的表达，PCR 产物未突变则连接转入E.coli SURE2感受态的质粒表达出mRFP，菌落呈红色；PCR 产物突变则连接转入E.coli SURE2感受态的质粒不表达mRFP或者突变的mRFP，菌落呈白色.白色菌落占总菌落比例反映pLac－mRFP的突变情况，即反映酶的保真性.Taq DNA 聚合酶用作对照，各种菌落形态的结果见图8.

图8 DNA 聚合酶保真性比较（彩页见封3）Fig.8 Comparison of fidelity of DNA polymerases

图8 DNA 聚合酶保真性比较Fig.8 Comparison of fidelity of DNA polymerases

菌落计数结果见表3，Taq DNA 聚合酶具有较高的突变率，白色菌落占总菌落比例为12.5%，Pfu DNA 聚合酶具有高保真性，白色菌落占总菌落比例为1.66%.Taq DNA 聚合酶产物的突变比例是Pfu DNA 聚合酶产物突变比例的7.5倍，符合Taq DNA聚合酶突变率是Pfu DNA 聚合酶的7～8 倍.Pfu－DbpA DNA 聚合酶产物白色菌落占总菌落比例为1.53%.与Pfu DNA 聚合酶进行t检测P＝0.47＞0.05，说明Pfu－DbpA DNA 聚合酶与Pfu DNA 聚合酶保真性无明显差异，DbpA 融合表达不影响Pfu DNA 聚合酶的高保真性.Pfu－DbpA DNA 聚合酶扩增5kbλDNA 片段经测序验证序列不存在突变，也证明Pfu－DbpA DNA 聚合酶具有高保真性.

表3 DNA聚合酶保真性比较Tab.3 Comparison of fidelity of DNA polymerase

3 讨论

Pfu DNA 聚合酶是来自古生菌Pyrococcus furiosus，具有高保真性，但延伸速度慢，持续合成能力差.改造提高Pfu DNA 聚合酶的延伸速度和持续合成能力具有重要的使用价值.

在细胞内存在“DNA sliding clamp”、thioredoxin、UL42等蛋白因子阻止DNA 聚合酶与模板的解离，提高DNA 聚合酶的持续合成能力和延伸速度［18－20］.2004年，Wang等报道非特异性双链DNA 结合蛋白Sso7d融合表达提高了DNA 聚合酶的持续合成能力和延伸速度.Sso7d与双链DNA 的结合阻止DNA聚合酶与模板的解离，提高了DNA 聚合酶的持续合成能力，同时不影响酶的催化能力和dNTP的掺入效率.因具有分子质量小、热稳定的特征，Sso7d不影响DNA 聚合酶自身的热稳定性.

其余非特异性双链DNA 结合蛋白融合表达是否提高DNA 聚合酶的延伸速度和持续合成能力，以及是否存在效果优于Sso7d的非特异性双链DNA 结合蛋白尚属未知.通过NCBI检索发现，DbpA 是一种分子质量小、热稳定的非特异性双链DNA 结合蛋白.本研究探索DbpA 融合表达提高Pfu DNA 聚合酶的效果，扩展已有对非特异性双链DNA 结合蛋白提高DNA 聚合酶性能的认知.

实验结果表明，DbpA 融合表达得到Pfu－DbpA DNA 聚合酶不影响Pfu DNA 聚合酶自身的热稳定性和保真性.延伸速度实验和扩增效率实验结果表明Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度快于Pfu DNA 聚合酶.Pfu－DbpA DNA 聚合酶具有更高的耐盐性，能够适应更广泛的缓冲液体系，同时说明具有更强的持续合成能力.持续合成能力的提高导致延伸速度的加快，也暗示Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度比Pfu DNA 聚合酶快.但荧光实时定量结果表明Pfu－DbpA DNA 聚合酶对Eva Green敏感，不适用于荧光实时定量PCR.延伸速度加快导致Pfu－DbpA DNA 聚合酶在实际应用中比Pfu DNA 聚合酶具有更好的效果.

通过与2004年Wang等的报道对比发现，DbpA 和Sso7d都能提高Pfu DNA 聚合酶的延伸速度和持续合成能力，但DbpA 效果比Sso7d差.说明非特异性双链DNA 结合蛋白融合表达能增强DNA 聚合酶与模板的结合能力，从而提高DNA 聚合酶的持续合成能力，进而提高延伸速度并且不影响保真性.但非特异性双链DNA 结合蛋白提高DNA 聚合酶性能存在分子特异性，因不同的双链DNA 结合蛋白与DNA 结合能力不同，阻止DNA 聚合酶与DNA 模板解离的能力也不同.其余非特异性双链DNA 结合蛋白对DNA 聚合酶性能提高的影响如何，效果是否优于Sso7d仍有待进一步的研究.

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