香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖作用的研究

管频，于化鹏，吴智勇，李伟，吴洁

香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖作用的研究

管频1，2，于化鹏1△，吴智勇2，李伟2，吴洁3

目的探讨香烟提取物（CSE）对人气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖以及钙网织蛋白（CRT）、CCAAT增强子结合蛋白α（CEBPα）表达的影响及机制。方法（1）通过收集经不同浓度CSE处理24 h的ASMCs，分为对照组、2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组。以MTT法分析各组细胞增殖情况，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞CEBPα的mRNA水平；免疫印迹法检测4组细胞CRT、CEBPα的蛋白水平。（2）在10%CSE组，分别在ASMCs中转染阴性对照siRNA、CRT的siRNA，比较2组ASMCs的CEBPα、CRT表达及细胞增殖情况。结果（1）对照组、2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组ASMCs的CEBPα蛋白表达依次递减，CRT和细胞增殖程度呈依次增高（P＜0.05）；而CEBPα mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）在10%CSE作用下，CRTsiRNA组中ASMCs的CEBPα表达较阴性对照siRNA组增强（P＜0.05），而CRT和细胞增殖程度均较相应阴性对照siRNA组减弱（P＜0.05）。结论CSE可使ASMCs中CRT的表达增强，从而抑制CEBPα mRNA的翻译，使CEBPα的表达减少，最终促进ASMCs的增殖。

肌细胞，平滑肌；细胞增殖；肺疾病，慢性阻塞性；体外研究；香烟提取物；钙网织蛋白；CCAAT增强子结合蛋白

CCAAT增强子结合蛋白α（CEBPα）广泛表达于肺、肝脏及骨髓干细胞等，可抑制细胞增殖的活性［1］。Borger等［2］研究显示，在哮喘患者气道平滑肌细胞（ASMCs）中CEBPα的表达明显下调。Miglino等［3］研究显示，在体外以室内尘螨作用于哮喘患者的ASMCs后，CEBPα的表达受抑制，从而使AMSCs的增殖明显增加。进一步研究认为，人AMSCs中CEBPα的表达受抑制与钙网织蛋白（CRT）密切相关［4］。慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者ASMCs的显著增生是COPD气道重塑的基础之一［5］。体外研究显示，在香烟提取物（CSE）作用下AMSCs的增殖加速［6］，但具体机制尚未明确。本研究旨在探讨CSE促进ASMCs增殖的可能机制，为研究COPD患者的气道重塑提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料原代ASMCs购自美国ScienceCell公司，于37℃、5%CO2孵箱中培养，取第4～6代细胞用于后续实验；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；羊抗人CEBPα、CRT及内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自上海吉泰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗羊单克隆抗体、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、Radio-Immunoprecipitation Assay（RIPA）裂解液、Trizol及DMEM胎牛血清购自武汉博士德生物技术有限公司。CRT⁃siRNA、阴性对照siRNA转染试剂盒及CEBPα的引物购自上海生工生物有限公司。

1.2 CSE的制备及分组按文献［7］的方法，将1支3R4F参考香烟（海南医学院热带检验学院实验室赠予）点燃，其过滤嘴端接一根橡皮管，橡皮管的另一端接注射器。收集烟雾注入含25 mL 10%胎牛血清DMEM的玻璃瓶中，摇晃玻璃瓶使烟雾溶入10%胎牛血清DMEM中，即为100%的CSE原液，以0.22 μm微孔滤膜过滤。CSE原液采用10%胎牛血清DMEM稀释，按照稀释浓度=CSE原液体积/总体积×100%计算。分别将含2.5%、5%、10%CSE的10%胎牛血清DMEM加入到细胞培养瓶中，即为2.5%CSE组、5%CSE组、10% CSE组，以不加入CSE者设为对照组。每组设6个复孔，培养24 h。

1.3 方法

1.3.1 MTT比色法检测人ASMCs的增殖程度各组每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑盐（MTT）20 μL，孵育4 h，1 500 r/min离心10 min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，摇匀，用免疫酶标仪（490 nm处）测定各孔培养液光密度（OD490）值。

1.3.2 RT-PCR法测定各组ASMCs中CEBPα mRNA表达各组分别以Trizol抽提细胞总RNA。按照逆转录试剂盒说明进行反转录生成cDNA。由CEBPα引物（扩增片段210 bp）：上游5′-GGCGGCGACTTTGACTACC-3′；下游5′-CTGCTTGGCTTATCCTCCTC-3′。扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃再延伸6 min。β-actin引物（扩增片段620 bp）：上游5′-ACACTGTGCCCATCTACGACG-3′；下游5′-AGGGGCCG⁃GACTCCTCATACT-3′。扩增条件：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃再延伸6 min。所有扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用MUVB220凝胶成像分析系统对扩增产物测定CEBPα基因及内参β-actin的灰度值，取CEBPα与β-actin比值为CEBPα mRNA的相对含量。

1.3.3 免疫印迹法（Western blot）测定各组ASMCs中CEBPα、CRT的蛋白表达提取各组细胞总蛋白，以SDSPAGE进行电泳，转膜，以5%牛血清白蛋白封闭，分别加入羊抗人CRT（44 ku）、CEBPα（42 ku）和GAPDH（36 ku）抗体，再予辣根过氧化物酶标记相对应的兔抗羊IgG单克隆抗体进行孵育，以DAB进行酶底物显色反应。滤膜照片通过凝胶成像系统定量扫描灰度值，分别以CEBPα/GAPDH、CRT/ GAPDH来表示CEBPα、CRT的蛋白表达水平。

1.3.4 采用siRNA技术干预后CEBPα、CRT及细胞增殖程度变化在10%CSE浓度条件下，通过分别对人ASMCs转染阴性对照siRNA、CRT siRNA相应分为阴性对照siRNA组、CRT siRNA组。检测2组人ASMCs中CRT、CEBPα的表达及增殖程度并进行比较。CRT siRNA组及阴性对照siRNA组的转染分别按照相应试剂盒说明书进行，待ASMCs细胞融合至80%左右置于6孔板中，分别以50 nmol/L的相应siRNA转染7 h，然后均加入新鲜的DMEM培养24 h，再予10%CSE作用24 h后收集细胞，检测2组CEBPα、CRT及细胞增殖程度表达。

1.4 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。2组计量资料的比较采用独立样本资料t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度CSE下ASMCs的CEBPα、CRT表达及ASMCs增殖程度不同CSE浓度组间人ASMCs的CEBPα mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），细胞增殖程度（OD490）依次增高，见图1、表1。随着CSE浓度增加，CEBPα蛋白表达依次降低，CRT表达依次增加，见图2。

2.2 CRTsiRNA组和阴性对照siRNA组中ASMCs的CRT、CEBPα的表达及细胞增殖程度比较CRT siRNA组CEBPα高于阴性对照siRNA组，CRT和细胞增殖程度低于阴性对照siRNA组（P＜0.05），见表2。

3 讨论

CEBPα是重要的具有抑制细胞增殖活性的转录因子［8］。CEBPα有42 ku和30 ku 2种异构体，分别称为P42CEBPα和P30CEBPα，它们是由同一个mRNA通过“核糖体跳跃机制”翻译得到的产物，P42CEBPα在N端比P30CEBPα长出12 ku的区域内含有转录激活功能较强的AD区及抑制有丝分裂的功能域，因此P30CEBPα转录激活功能较弱，且没有抗有丝分裂的作用，因而不能抑制细胞的增殖［1］，仅P42CEBPα有相应生物学活性［9］。本研究结果显示，在CSE的作用下，随着其浓度的增高，ASMCs的增殖程度逐渐增加，而具有抗细胞增殖活性CEBPα的蛋白表达逐渐下降，表明CSE促进ASMCs增殖的机制可能与抑制CEBPα的表达有关。

Fig.1 The expression levels of CEBPα mRNA under different concentrations of CSE in four groups图1 各组不同浓度CSE下CEBPα mRNA表达

Tab.1 The expression levels and proliferation of CEBPα and CRT in four groups表1 各组ASMCs中CEBPα mRNA、CEBPα、CRT的表达及细胞增殖程度（n=6，）

Tab.1 The expression levels and proliferation of CEBPα and CRT in four groups表1 各组ASMCs中CEBPα mRNA、CEBPα、CRT的表达及细胞增殖程度（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与（1），b与（2），c与（3）比较，P＜0.05

组别对照组（1）2.5%CSE组（2）5%CSE组（3）10%CSE组（4）F CEBPα mRNA 0.661±0.133 0.696±0.126 0.713±0.125 0.677±0.142 0.174 CEBPα 0.733±0.101 0.622±0.084a0.497±0.098ab0.368±0.077abc18.238＊＊组别对照组（1）2.5%CSE组（2）5%CSE组（3）10%CSE组（4）F CRT 0.293±0.092 0.489±0.088a0.620±0.103ab0.770±0.087abc28.628＊＊ASMCs增殖（OD490nm）0.187±0.024 0.270±0.033a0.321±0.041ab0.368±0.043abc28.063＊＊

Fig.2 The expression levels of CEBPα protein and CRT under different concentrations of CSE in four groups图2 各组不同浓度CSE下CEBPα蛋白和CRT水平的表达

Tab.2 The expression levels and proliferation of CRTand CEBPα in CRT-siRNA group and control group表2 CRTsiRNA组、阴性对照siRNA组中CRT、CEBPα的表达及细胞增殖程度（n=6）

Tab.2 The expression levels and proliferation of CRTand CEBPα in CRT-siRNA group and control group表2 CRTsiRNA组、阴性对照siRNA组中CRT、CEBPα的表达及细胞增殖程度（n=6）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别阴性对照siRNA组CRT siRNA组t OD4900.390±0.079 0.265±0.060 3.101＊＊CEBPα 0.247±0.063 0.380±0.180 2.616＊CRT 0.754±0.126 0.544±0.132 2.826＊

CRT是参与CEBPα mRNA翻译的重要调控因子之一。以往研究发现，在脂肪形成的过程中，CEBPα与CRT的表达呈负相关，CRT通过抑制CEBPα和PPARα的表达而促进脂肪的合成［10］。近期在ASMCs中的研究也发现CEBPα的表达受CRT负调节［4］。可能机制为CRT与CEBPαmRNA茎环结合形成GC富集模体，这种复合物抑制了CEBPα mRNA翻译为全长42 ku的CEBPα，从而抑制了其生物学活性［11］。本研究结果显示，不同CSE浓度作用下CEBPα mRNA表达无差异，但CEBPα蛋白的表达随浓度增加呈依次降低，表明CSE对于ASMCs的作用主要是调控CEBPα的转录后水平，从而影响其蛋白表达；CRT的表达随着CSE浓度增高逐渐增强，提示香烟烟雾可能作用于ASMCs后使CRT表达上调，通过抑制CEBPα mRNA的翻译，从而使全长CEBPα（P42）的蛋白水平下降，进而促进ASMCs细胞增殖。另外，本研究采用siRNA技术抑制CRT的表达后，相应的CEBPα（P42）蛋白表达增加，从而使ASMCs的增殖相应减弱，进一步证实了CRT、CEBPα之间的关系，提示抑制CRT的表达可减轻气道平滑肌的增殖，从而改善气道重塑、减轻气道炎症，此可能为探索COPD发病机制和治疗方法提供一个新的切入点。

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（2014-11-26收稿2015-01-05修回）

（本文编辑陆荣展）

Effects of tobacco extract on proliferation of human airway smooth muscle cells

GUAN Pin1，2，YU Huapeng1△，WU Zhiyong2，LI Wei2，WU Jie3
1 Southern Medical University，Guangzhou 510000，China；2 Department of Medical Health Center，Hainan Provincial People Hospital；3 Hainan Medical University，Haikou△

ObjectiveTo explore the effects and mechanism of cigarette smoke extract（CSE）on the proliferation of air⁃way smooth muscle cells（ASMCs）and the expression of CCAAT/enhancer-binding protein（CEBPα）and calreticulin.Methods（1）The ASMCs were stimulated with different concentrations of CSE for twenty-four hours.According to the concentra⁃tions of CSE，the cells were divided into control group，2.5%CSE group，5%CSE group and 10%CSE group.The prolifera⁃tion of ASMCs was measured by MTT colrimetric method.The CEBPαmRNA was analyzed by RT-PCR.Western bloting as⁃say was performed to detect the levels of CRT and CEBPα protein.（2）In 10%CSE group，transfection of the siRNA respec⁃tively for negative control or calreticulin was performed in accordance with instructions.The cell proliferation and the expres⁃sion of calreticulin and CEBPα were compared in negative control siRNA group and calreticulin siRNA group.Results（1）With the increasing of the concentrations of CSE，the protein expression of CEBPα decreased gradually（P＜0.05），while the proliferation of ASMCs and the protein expression of calreticulin increased（P＜0.05），but the expression of CEBPα mRNA in ASMCs showed no significant difference in groups with different concentrations of CSE（P＞0.05）.（2）Under the 10%CSE，the expression of CEBPα was significantly higher in CRT siRNA group than that in negative control group（P＜0.05），but the cell proliferation and CRT were significantly lower in the calreticulin siRNA group than those in negative control siRNA group（P＜0.05）.ConclusionThe CSE exposure contributes to the expression of calreticulin protein，and then inhibits the translation of CEBPα mRNA，thus promotes the proliferation of ASMCs.

myocytes，smooth muscle；cell proliferation；pulmonary disease，chronic obstructive；in vitro；cigarette smoke extract；calreticulin；CCAAT enhancer-binding protein

R655.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.005

海南省自然科学基金资助课题（807081）

1广东广州南方医科大学（邮编510000）；2海口，海南省人民医院医疗保健四区；3海口，海南医学院

管频（1980），女，医学博士，主治医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病气道重塑及气道炎症研究

△通讯作者E-mail：gp0318@126.com