法舒地尔对脓毒症所致急性肺损伤及肺组织中HMGB1表达的影响

赵 振 韦广粤

1.桂林医学院研究生院，桂林 541004；2.桂林医学院附属医院急诊科，桂林 541004

法舒地尔对脓毒症所致急性肺损伤及肺组织中HMGB1表达的影响

赵 振1韦广粤2▲

1.桂林医学院研究生院，桂林 541004；2.桂林医学院附属医院急诊科，桂林 541004

目的观察法舒地尔对小鼠脓毒症所致急性肺损伤的影响及其使用与否对肺组织中HMGB1表达量的影响。 方法将48只BALB-C小鼠随机分为对照组、盲肠结扎穿刺（CLP）组、法舒地尔预处理组，在6、24 h时间点取血、肺泡灌洗液及鼠肺用于结果分析。 结果在6、24 h时间点，法舒地尔可以显著降低CLP所致的小鼠血清中TNF-α及HMGB1和肺泡灌洗液中蛋白浓度的增加。除此之外，法舒地尔预处理还可以逆转CLP诱导的小鼠肺组织病理形态改变。同时，法舒地尔能减少CLP所致小鼠肺组织中HMGB1mRNA表达量的增加。结论法舒地尔能减轻CLP小鼠所致的肺损伤并降低肺组织中HMGB1的表达。

法舒地尔；脓毒症；急性肺损伤；Rho激酶；HMGB1

革兰氏阴性菌引起的脓毒症仍然是导致急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的常见原因之一［1］，其主要机制是细菌内毒素释放进入血液循环，激活肺的炎症级联反应，最终导致肺损伤［2-3］。炎性介质的产生在肺损伤的病理生理机制中起重要的作用。法舒地尔作为一种特异的Rho激酶抑制剂，在临床上主要应用于治疗脑血管痉挛，改善脑组织微循环等［4-7］，然而随着对Rho激酶的进一步研究发现其是一种参与多种细胞功能的重要分子开关，并且其抑制剂可减少NF-κB活化，大大减少促炎性细胞因子和趋化因子的产生，从而使TNF-α，IL-1β等细胞因子的表达减少［8-9］。目前对其抗炎作用的研究多集中在炎症早期。高迁移率族蛋白1（HMGB1）作为一个重要的炎症介质，在内毒素血症晚期被释放。HMGB1在血清中的水平与脓毒症患者的死亡率呈正相关［10］，因此本实验希望通过探讨法舒地尔对脓毒症肺组织中HMGB1表达的影响，完善法舒地尔治疗脓毒症所致肺损伤可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级BALB-C小鼠，48只，雌雄不拘，体重25～30 g，由桂林医学院实验动物中心提供。

1.2 主要仪器设备及试剂

酶标仪、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、光学显微镜、盐酸法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司，批号1106021）、小鼠HMGB1 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）、小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）、TRIzon总RNA提取试剂 （北京康为世纪生物科技有限公司）、RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒（Thermo，美国）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.3 CLP肺损伤模型制备及分组

48只BALB-C小鼠随机分为生理盐水对照组（NS组，n=16）、盲肠结扎穿刺组（CLP组，n=16）、法舒地尔（天津红日药业股份有限公司，批号1106021）预处理组（FAS组，n=16）。其中按处死时间不同分为NS 6 h组，NS 24 h组；CLP 6 h组，CLP 24 h组；FAS 6 h组，FAS 24 h组6个亚组，每组8只。FAS组在造模前18 h和30min腹腔注射法舒地尔10mg/kg，NS组和CLP组给予等量的生理盐水。CLP组和FAS组使用水合氯醛麻醉后，腹部备皮，取正中切口，确定盲肠位置后游离周围血管，盲肠末端1 cm处4号线结扎盲肠，7号穿刺针在远心端穿刺，挤出少许粪便后，将盲肠还纳腹腔，缝皮。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 肺组织病理形态学观察 小鼠取血处死后，立即开胸，结扎一侧肺组织，沿主支气管注入0.7 ml，10%甲醛溶液后结扎该侧支气管放入甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肺组织的病理形态变化。

1.4.2 血清TNF-α、HMGB1检测 小鼠摘取眼球取血0.8ml，常温静置30min～2 h，以3900 r/min离心25min，取上清放置于-20℃冰箱内保存，使用ELISA试剂盒测定小鼠血清TNF-α、HMGB1浓度。

1.4.3 肺泡灌洗液总蛋白浓度测定 小鼠处死后，做颈部切口，游离小鼠气管，以生理盐水进行灌洗，回收灌洗液，3000 r/min离心25min，离心后取上清液放置于-20℃冰箱内保存，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定肺泡灌洗液总蛋白浓度。

1.4.4 肺组织HMGB1 mRNA的表达 无菌取一侧小鼠肺组织，TRIzon法提取细胞总RNA。采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对转录产物进行扩增，β-肌动蛋白（β-actin）作为内参。小鼠HMGB1引物序列（扩增片段为174 bp）：5'-CGGATGCTTCTGTCAACTTC-3'（前引物）；5'-TGAACTTCTTTTTGGTCTCC-3'（后引物）。小鼠β-actin引物序列（扩增片段为445 bp）：5'-GAGGGAAATC GTGCGTGAC-3'（前引物）；5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'（后引物）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后进行照相并测定光密度值，以目的基因与内参光密度值的比值作为基因表达的相对含量。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物的一般情况

CLP组的小鼠在手术后活动能力下降明显、精神萎靡、呼吸急促、厌食；24 h组可出现竖毛、毛发光泽度下降、眼周分泌物增多、对外界反应淡漠。6 h组处死后解剖可见肠管明显扩张、肠系膜充血。24 h组处死后解剖可见上述表现进一步加剧且可见血性或脓性腹水，带臭味。肝大明显。FAS组亦出现上述症状，不过较CLP组轻微，其中24 h组改善较明显。NS组小鼠如常，无相应表现。

2.2 肺组织病理形态学改变

光镜下可见，NS组小鼠肺组织为正常肺组织，结构清晰完整未见水肿，仅可见有少量炎性细胞。CLP组可见肺组织结构破坏严重，肺泡萎陷，小鼠的肺中有明显炎症细胞浸润，间质水肿，血管充血和出血。FAS组中小鼠肺组织结构基本完整，虽也可见肺内有炎性细胞浸润，但较CLP组明显减轻（图1）。

图1 光镜下5组小鼠肺组织HE染色（×400）

2.3 血清中TNF-α、HMGB1浓度测定结果

比较各组小鼠血清中的TNF-α水平：除FAS组的24 h时间点外，各组的浓度明显高于NS组（P＜0.05），法舒地尔预处理能显著降低6 h时间点时脓毒症小鼠血清中的TNF-α水平（P＜0.05），而在24 h时间点时，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。比较各组小鼠血清中的HMGB1水平：各组的浓度均高于NS组（P＜0.05），法舒地尔预处理能显著降低24 h时间点时脓毒症小鼠血清中的HMGB1水平（P＜0.05），而在6 h时间点时，两组差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组小鼠血清TNF-α、HMGB-1的表达（pg/m I±s，n=5）

表1 各组小鼠血清TNF-α、HMGB-1的表达（pg/m I±s，n=5）

与同时间点NS组比较，*P＜0.05；与CLP组同时间点比较，#P＜0.05；与同组6 h比较，▲P＜0.05

组别 TNF-α HMGB1 NS组6 h 24 h CLP组6 h 24 h FAS组6 h 24 h 29.47±2.52 30.24±1.20 22.97±3.80 30.66±4.78 48.66±5.16*34.81±4.58*▲38.96±7.63*77.32±15.07*▲38.11±6.71*#30.03±3.90▲29.18±5.66*62.06±11.59*#▲

2.4 小鼠肺泡灌洗液总蛋白浓度测定及肺组织HMGB-1mRNA的表达结果

比较各组小鼠肺泡灌洗液总蛋白浓度：除FAS组的6 h时间点外，各组的肺泡灌洗液总蛋白浓度明显高于同时间点的NS组（P＜0.05），法舒地尔预处理能显著降低各时间点内的肺泡灌洗液中的总蛋白浓度（P＜0.05）（表2）。比较各组小鼠肺组织HMGB1 mRNA的表达：除FAS组的6 h时间点外，各组小鼠肺组织HMGB1 mRNA的表达明显高于同时间点的NS组（P＜0.05），法舒地尔能显著降低24 h时间点时脓毒症小鼠肺组织HMGB1 mRNA的表达（P＜0.05），而在6 h时间点时，这种降低作用不显著（P= 0.07）（表2、图2）。

表2 各组小鼠肺泡灌洗液总蛋白浓度（m g/m I）及肺组织HMGB1 m RNA的光密度比值测定（x±s，n=3）

图2 5组小鼠肺组织HMGB1的表达情况

3 讨论

在CLP术后，肠道作为脓毒症的始动器官，在肠道内细菌毒素的刺激下通透性增加，细菌本身及其分泌产物大量经肠道吸收入血进入血液循环并分布于机体各主要器官及组织。肺脏由于其双重血供、血管网密集和大量的肺泡间隙等特殊的解剖组织学特征致使血液内的毒素和炎性细胞大量通过，并容留其中，这些炎性细胞大量释放各种蛋白酶和炎症因子，进一步加重肺损伤［11］。

CLP模型肺损伤的严重程度与毛细血管渗漏和肺水肿的显著性相关［12］。在本实验中，可通过肺泡灌洗液中蛋白质的浓度及其光镜下的病理改变加以证明，CLP组的小鼠的肺泡灌洗液浓度随时间的延长而逐渐增高。同样，在病理切片的观察中，也可以发现CLP组小鼠肺中的炎症细胞浸润，间质水肿，血管充血和出血也随时间的延长而逐渐增高。Rho和Rho激酶参与中性粒细胞的激活，从而增加内皮通透性和细胞因子介导的屏障功能障碍加重，因此法舒地尔作为特异性的Rho激酶抑制剂可预防中性粒细胞依赖性的氧化-炎症通路的激活，从而有助于减少液体外渗和组织病理学的改善［13-14］。研究亦表明，法舒地尔无论在炎症早期（6 h时间点）还是炎症中晚期（24 h时间点）均可显著降低肺泡灌洗液中的蛋白浓度，并使病理切片中的炎症表现得到较大缓解。

既往认为，早期促炎介质（TNF-α、IL-1等）是脓毒症引起肺损伤时机体失控性炎性反应的关键介质，然而在临床中采用TNF-α拮抗剂治疗并未取得满意效果，究其原因，可能是这些早期炎症因子只在炎症早期一过性升高，而此时患者可能并未入院治疗，而其拮抗剂发挥作用时，这些因子早已恢复正常水平［15］。近年来一种“晚期”炎症介质——HMGB1逐渐进入人们的视野，其通常在炎症发生的6 h后才开始升高，24 h达到高峰，并长期处于高表达的状态，因此成为多种疾病治疗的新靶点。与TNF-α相似，在体外实验中，HMGB1处理过的细胞出现肺脏内细胞局部炎症时的表现，其可通过使血管内皮细胞骨架肌动蛋白重构而使细胞形态改变，细胞间隙增加［16］。在本实验中，采用ELISA检测各组小鼠血液中早期炎症因子TNF-α和中晚期炎症因子HMGB1，结果显示，在CLP模型中TNF-α仅在炎症早期一过性增高，至24 h时间点时其表达明显下降，而HMGB1在炎症早期（6 h时间点）开始增加，并在24 h时间点时仍持续增加。同时，采用PCR的方法检测各组小鼠肺组织中的HMGB1 mRNA的含量，结果显示，CLP模型组的HMGB1mRNA表达量也随炎症时间的延长呈持续增高。有实验表明，Rho激酶参与多种诱导转录因子的活化，如NF-κB和AP-1等［17-19］，而这些转录因子的出现对于转录一些炎症基因（TNF-α，HMGB1等）起关键作用［20］，因此本实验中，FAS各时间组小鼠血液中TNF-α、HMGB1等炎症因子的表达均低于同时间组的CLP模型组。同理，FAS组小鼠肺组织中的HMGB1 mRNA的含量也低于同时间组的CLP模型组，尤以24 h组明显。

总之，在采用CLP手术致小鼠腹部脓毒症的模型中，可以发现法舒地尔作为一种特异性的Rho激酶抑制剂使用预处理的方式能减轻脓毒症所致的不同时间点的急性肺损伤，减少肺组织的病理改变，其发挥的抗炎作用可能不仅局限于炎症的早期阶段，也可能通过下调HMGB1的表达等方式在炎症的中晚期发挥作用。

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The influence of fasudil on acute lung injury induced by sePsis and the HMGB1 exPression in lung tissue

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1.Graduate School，Guilin Medical College，Guilin 541004，China；2.Department of Emergency，Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004，China

Objective To observe the influence of fasudil on acute lung injury induced by sepsis inmice and the influence of using fasudil or not on the expression quality of HMGB1.Methods 48 BALB-Cmice were randomly divided into the control group，the cecal ligation and puncture（CLP）group，the fasudil preconditioning group.Blood，bronchoalveolar lavage fluid and lung ofmice was taken respectively at 6 and 24 hours time point for the analysis of results.Results At 6 and 24 hours time point，the increased TNF-αand HMGB1 level in serum and protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid induced by CLP could be significantly reduced.In addition，pathological changes of lung tissue in mice was reversed by the fasudil preconditioning.At the same time，increased the expression quality of HMGB1 mRNA induced by CLP lung tissue in mice were reduced by fasudil.Conclusion Fasudil can alleviate the lung injury induced by CLP inmice and reduce the expression of HMGB1 of lung tissue.

Fasudil；Spesis；Acute lung injury；Rho kinase；HMGB1

R332

A

1674-4721（2015）02（c）-0004-04

2014-10-09本文编辑：许俊琴）

赵振（1989-），男，2012级在读硕士研究生，急诊医学专业（重症方面）

▲通讯作者：韦广粤（1964-），男，主任医师，教授，硕士研究生导师，研究方向：呼吸机的临床应用