糖尿病大鼠阴茎组织中糖基化终产物、诱导型一氧化氮合酶的表达分析

杨 超 丁永学 孔垂泽 刻校吾 张阁均

1.辽阳市中心医院泌尿外科，辽宁辽阳 111000；2.中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110000

糖尿病大鼠阴茎组织中糖基化终产物、诱导型一氧化氮合酶的表达分析

杨 超1丁永学1孔垂泽2刻校吾2张阁均2

1.辽阳市中心医院泌尿外科，辽宁辽阳 111000；2.中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110000

目的探讨糖尿病大鼠阴茎组织糖基化终产物（AGEs）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达变化及它们表达的相关性。 方法64只雄性Wistar大鼠随机分为糖尿病模型组（DM组）和对照组（NC组），各32只。在DM组大鼠模型制备成功后的4、8、12、20周，两组各杀检8只大鼠。使用免疫组织化学法观察阴茎组织中AGEs、iNOS的表达定位同时分析其含量变化，使用Real-time PCR检测阴茎组织中AGEs、iNOSmRNA的表达情况。结果大量AGEs和iNOS阳性细胞分别出现于4、8、12、20周DM模型大鼠阴茎组织内，其累计光密度（IOD）值高于对照组，并随病程进展而增高（P＜0.05，P＜0.01）。Real-time PCR结果显示，NC组大鼠在造模后4、8、12、20周AGEs和iNOS的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），DM模型大鼠阴茎组织AGEs和iNOSmRNA表达水平随着病程进展逐渐增加（P＜0.01），且高于相同时间点的NC组（P＜0.01），Pearson相关分析显示，DM大鼠阴茎组织AGEs与iNOS的表达水平呈显著正相关（r=0.845，P＜0.01）。 结论高血糖状态下，阴茎组织内AGEs和iNOS的表达显著增加并呈正相关，可能共同参与了DM阴茎损害的发生。

糖尿病；阴茎组织；糖基化终产物；诱导型一氧化氮合酶；大鼠

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种由于胰岛素相对或绝对缺乏引起糖代谢异常的内分泌系统疾病，长期的高血糖状态导致患者出现心脑血管、肾、眼底等多器官的并发症，其中勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是糖尿病常见并发症之一，有报道糖尿病性ED发病率高达75%，较非糖尿病患者高3倍，并随年龄的增长和病程的延长而明显增加；10年以内病史者，50%以上合并ED，且糖尿病性ED（DMED）患者比普通ED患者症状更为严重［1］。DMED的发病机制目前尚不清楚，本实验采用免疫组织化学法和Real-time PCR动态观察DM大鼠阴茎组织糖基化终末产物（AGEs）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的变化及两者的关系，初步探讨DMED的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与取材

将64只SPF级Wistar大鼠［雄性，2月龄，体质量为（200±20）g，由中国医科大学动物实验中心提供］随机分入糖尿病（DM）组和正常对照（NC）组，每组各32只。禁食12 h后，以65 mg/kg的剂量向DM组大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ，购自Sigma公司）溶液，NG组注射同体积的枸橼酸缓冲液。72 h后测尾静脉血葡萄糖浓度＞16.7 mmol/L（罗氏诊断公司产品），并持续1周为模型成功。分别在实验第4、8、16、20周末脱颈椎处死两组大鼠各8只，消毒后切取阴茎组织，仔细分离表皮，剪除阴茎头和阴茎脚部，留取海绵体组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制备蜡块。并同时留取各组大鼠的新鲜阴茎组织，置于TRIzol中，留作提取RNA。

1.2 免疫组织化学法

将制备的组织蜡块使用切片机切片，厚度5μm，于42℃水浴展片，贴于载玻片上，65℃烤片2 h后，经过二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，100%乙醇Ⅰ5min，100%乙醇Ⅱ5 min，90%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5min，梯度透明，然后枸橼酸钠缓冲液（10mmol，pH 6.0）中高压锅内煮沸，上气3 min后缓慢冷却进行抗原修复，然后使用SP免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）进行染色。免疫组织化学所用抗体为兔抗大鼠多克隆AGEs抗体（天津医大基础医学院）和兔抗大鼠iNOS型多克隆抗体（武汉博士德生物制品司），使用浓度分别为1∶500和1∶75稀释。结果判定：光镜下见组织切片细胞胞质、胞膜出现棕黄色或黄色颗粒者为阳性细胞。图像分析：Meta Morph高清晰度彩色医学图文分析系统（美国UIC公司）对免疫组织化学切片随机选取高倍视野，每张切片随机选取10个视野（×400），对图片阳性区域进行累计光密度值IOD量化测定。

1.3 Real-time PCR

取两组大鼠的阴茎组织，根据Trizol法提取大鼠阴茎组织的总RNA，经逆转录得cDNA，用AGEs和iNOS的特异性引物检测AGEs和iNOS的表达，引物序列（上海生工）如下：AGEs：sense5'-TCCCCCACAGTGTTTCACAGT-3'，anti-sense 5'-GTGGACCCAGCAGG CTATGT-3'，扩增长度为100 bp，iNOS：sense 5'-CA CGACCCAGACTTCAGAGTA-3'，anti-sense 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，扩增片段长度为339 bp，GAPDH：sense5'-AGAGGAGAGGAAGGCCCCAGA-3'，anti-sense 5'-GGCAAGGTGGGGTTATACAGG-3'扩增片段为239 bp，循环参数为：94℃预变性2 min；94℃15 s，64℃40 s，40次循环。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 AGEs在DM模型大鼠阴茎组织中的表达

NC组大鼠在造模后4、8、12、20周，AGEs的表达量差异无统计学意义 （P＞0.05），DM模型大鼠阴茎海绵体组织于第4周可见大量的AGEs阳性细胞，随着病程进展，8、12、20周DM模型大鼠AGEs的表达量逐渐增加（P＜0.01），且4、8、12、20周各时间点DM组大鼠的AGEs阳性细胞累计光密度值明显高于NC组（P＜0.01）（图1、表1）。

图1 免疫组织化学检测两组大鼠阴茎海绵体组织AGEs的表达情况

表1 两组大鼠阴茎海绵体组织AGEs累计光密度值的比较（±s）

表1 两组大鼠阴茎海绵体组织AGEs累计光密度值的比较（±s）

与NC组同时间比较，*P＜0.01；4、8、12、20周DM组内比较，#P＜0.01

组别 n 4周 8周 12周 20周NC组DM组88 2.159±0.186 2.718±0.290*#2.198±0.248 3.623±0.333*#2.292±0.316 4.210±0.402*#2.382±0.338 4.899±0.555*#

2.2 AGEsmRNA在DM模型大鼠阴茎组织中的表达

Real-time PCR结果显示，NC组大鼠在造模后4、8、12、20周AGEsmRNA的表达量差异无统计学意义 （P＞0.05），DM模型大鼠AGEsmRNA的表达逐渐增加（P＜0.01），且明显高于NC组（P＜0.01）（图2）。

图2 AGEsm RNA在DM模型大鼠阴茎组织中的表达

2.3 iNOS在DM模型大鼠阴茎组织中的表达

NC组大鼠在造模后4、8、12、20周iNOS的表达量差异无统计学意义 （P＞0.05），DM模型大鼠阴茎海绵体组织于第4周可见大量的iNOS阳性细胞，随着病程进展，8、12、20周DM模型大鼠iNOS的表达量逐渐增加（P＜0.01），且4、8、12、20周各时间点，DM组大鼠的iNOS阳性细胞累计光密度值高于NC组 （P＜0.05，P＜0.01）（图3、表2）。

图3 免疫组化检测两组大鼠阴茎海绵体组织iNOS的表达情况

表2 两组大鼠阴茎海绵体组织iNOS累计光密度值的比较±s）

表2 两组大鼠阴茎海绵体组织iNOS累计光密度值的比较±s）

与NC组同时间比较，*P＜0.05，#P＜0.01；4、8、12、20周DM组内比较，▲P＜0.01

组别 n 4周 8周 12周 20周NC组DM组88 1.805±0.382 2.162±0.180*▲2.029±0.267 2.731±0.361#▲2.248±0.262 3.292±0.404#▲2.364±0.241 4.266±0.447#▲

2.4 iNOSmRNA在DM模型大鼠阴茎组织中的表达

Real-time PCR结果显示，NC组大鼠在造模后4、8、12、20周iNOSmRNA的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），DM模型大鼠iNOSmRNA的表达逐渐增加（P＜0.01），且明显高于NC组（P＜0.01）（图4）。

图4 iNOSm RNA在DM模型大鼠阴茎组织中的表达

2.5 AGEs、iNOS的相关性分析

Pearson相关分析结果显示，DM大鼠阴茎海绵体组织中AGEs、iNOS阳性细胞均随着病程的延长逐渐增加，两者累计光密度值之间呈显著正相关（r=0.845，P＜0.01）（图5）。

图5 AGEs、iNOS的相关性分析

3 讨论

阴茎解剖结构完整及海绵体平滑肌舒张是阴茎勃起的关键。DMED的发病机制还不是很清楚，大多研究认为与DM所致的血管、神经及海绵体血窦内皮等功能受损，影响阴茎海绵体平滑肌的舒张有关，导致阴茎ED［2-4］。近年来，一些研究显示，一氧化氮-环磷酸鸟苷（NO-cGMP）、AGEs［5］等因素也在DMED的发生中具有重要作用。本研究通过动态观察DM模型大鼠阴茎海绵体AGEs和iNOS的表达变化探讨两者在DMED发生过程中的机制。

AGEs是一种异质性的复合物，DM时持续高血糖可导致体内各种组织蛋白的非酶糖基化水平异常增高，使AGEs产量增高。Seftel等［6］发现，DM患者阴茎组织中AGEs含量较正常人高，而且主要沉积在DM患者阴茎海绵体组织和阴茎白膜胶原组织；大量实验表明，AGEs通过氧化应激引起阴茎血管、神经病变以及NO等多种勃起神经递质的改变，促进DMED的发生、发展［7］，这可能与AGEs和细胞膜表面受体RAGE相结合产生氧化应激反应，刺激活性氧簇ROS的生成有关。同时有研究显示，给予AGE抑制剂或抗氧化治疗可以改善DM大鼠的ED［8-10］。本研究中对造模后4、8、12、20周的大鼠阴茎组织AGEs蛋白及mRNA的表达进行动态观察，结果显示，随着造模时间的延长，AGES蛋白及mRNA的表达水平逐渐增高，而且高于NC大鼠，进一步说明AGEs在DMED的发病过程中具有重要作用，与前面的结果相一致。

L-Arg-NO-cGMP通路是阴茎勃起的重要机制，其中NO的产生是平滑肌舒张的关键影响因素。NOS是合成NO的关键酶，包括nNOS、eNOS和iNOS，其中nNOS和eNOS都在海绵体平滑肌舒张阴茎勃起中具有重要作用［11-12］，iNOS在正常、年轻的阴茎内仅有少量表达，主要在病理情况下表达升高，在正常生理情况下对NO的生成发挥作用较少［13］。Podlasek等［14］的研究表明，DM大鼠阴茎组织中nNOS和eNOS表达较正常大鼠低，而iNOS表达则高于正常大鼠。本研究结果显示，造模后4、8、12、20周的大鼠阴茎组织iNOS蛋白及mRNA的表达水平随着造模时间的延长逐渐增高，而且AGEs的表达水平与iNOS呈正相关，提示可能AGEs和iNOS通过某种联系在DMED过程中发挥作用。

有报道显示，一定环境中AGEs能促进iNOS表达［15］；Chang等［16］发现肾小球系膜细胞中AGEs通过p38MAPK依赖信号通路增强iNOs活性，催化生成过量的NO；Wang等［17］发现，AGEs诱导iNOS在鼠类小胶质细胞岬N-11中表达，促进了阿尔海默病的发生，因此本研究可能提示在DMED的发生过程中可能是长期的高血糖状态下AGEs表达增加，并诱导阴茎海绵体组织中iNOS的表达，造成过量的NO在组织中积聚。DM氧化应激状态下生成的大量ROS可与NO生成过氧化亚硝酸盐阴离子（ONOO-），消耗大量NO，降低了NO相对有效浓度［18-20］，从而影响了阴茎海绵体平滑肌的舒张功能，导致了DMED，而且AGEs 与iNOS的相互作用过程中产生大量的ROS、NO、ONOO-，可有细胞毒作用，通过多种途径介导阴茎组织细胞（平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞等）凋亡，影响阴茎的勃起功能。

综上所述，AGEs与iNOS的内在联系可能从一个全新的角度阐述DMED的发病机制，即高糖环境诱导阴茎组织AGEs表达增高，AGEs增加阴茎海绵体组织iNOS的量与活性，通过氧化应激、细胞凋亡、降低NO利用率等途径参与DMED的发生、发展，但是这种机制具体的发生过程还需要进一步通过加大样本量和相关指标的检测进行确认。

［1］Mekhtiev TV.Stress，anxiety，depression and erectile dysfunction in patientswith diabetes mellitus［J］.Georgian Med News，2013，（220-221）：77-81.

［2］黄炳昆，伍学焱.糖尿病与勃起功能障碍［J］.中华临床医师杂志（电子版），2013，7（8）：3236-3240.

［3］Amany S，Heba K.Effect of pregabalin on erectile function andpenileNOSexpression in ratswithstreptozotocin-induced diabetes［J］.Exp Clin EndocrinolDiabetes，2013，121（4）：230-233.

［4］王海鹏，姜华茂.糖尿病性大鼠勃起功能障碍的机制［J］.中国老年学杂志，2013，33（20）：5056-5058.

［5］NevesD.Advancedglycationend-products：acommonpathway in diabetes and age-related erectile dysfunction［J］.Free Radic Res，2013，47（Suppl 1）：49-69.

［6］Seftel AD，Vaziri ND，Ni Z，et al.Advanced glycation end products in human penis：elevation in diabetic tissue，site of deposition，and possible effect through iNOS or eNOS ［J］.Urology，1997，50（6）：1016-1026.

［7］Bansal S，Chawla D，Siddarth M，et al.A study on serum advanced glycation end products and its association with oxidative stress and paraoxonase activity in type 2 diabetic patientswith vascular complications［J］.Clin Biochem，2013，46（1-2）：109-114.

［8］刘丽，王文进，朱浩，等.诱导型一氧化氮合酶在糖尿病性阴茎勃起功能障碍大鼠阴茎的表达［J］.解剖学杂志，2013，36（3）：274-278.

［9］UstaMF，KendirciM，GurS，etal.Thebreakdownofpreformed advancedglycationendproductsreverseserectiledysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats：preventive versus curative treatment［J］.JSex Med，2006，3（2）：242-250.

［10］YamagishiS.Potential clinicalutility ofadvanced glycation end product cross-link breakers in age-and diabetesassociated disorders［J］.Rejuvenation Res，2012，15（6）：564-572.

［11］Wang L，Tian W，Uwais Z，et al.AGE-breaker ALT-711 plus insulin could restoreerectile function in streptozocininduced type 1 diabetic rats［J］.JSex Med，2014，11（6）：1452-1462.

［12］El-SisiAA，HegazySK，Salem KA，etal.Atorvastatin improves erectile dysfunction in patients initially irresponsive to Sildenafil by the activation of endothelial nitric oxide synthase［J］.Int J Impot Res，2013，25（4）：143-148.

［13］韦安阳，刘洋，何书华，等.糖尿病性大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡和增殖特征分析［J］.南方医科大学学报，2012，32（2）：155-159.

［14］Podlasek CA，Zelner DJ，Bervig TR，et al.Characterization and localization of nitric oxide synthase isoforms in the BB/WOR diabetic rat［J］.JUrol，2001，166（2）：746-755.

［15］Bansal S，Siddarth M，Chawla D，et al.Advanced glycation end productsenhance reactiveoxygen and nitrogen species generation in neutrophils in vitro［J］.Mol Cell Biochem，2012，361（1-2）：289-296.

［16］ChangPC，Chen TH，ChangCJ，etal.Advanced glycosylation end products induce inducible nitric oxide synthase （iNOS）expression via a p38 MAPK-dependent pathway ［J］.Kidney Int，2004，65（5）：1664-1675.

［17］Wang X，Yu S，Hu JP，etal.Streptozotocin-induced diabetes increases amyloid plaque deposition in AD transgenic mice through modulating AGEs/RAGE/NF-κB pathway ［J］.Int JNeurosci，2014，124（8）：601-608.

［18］Feng XT，Qin CB，Leng J，et al.Yidiyin，a Chinese herbal decoction，improveserectiledysfunction indiabeticpatients and ratsthrough theNO-cGMPpathway［J］.BiosciBiotechnol Biochem，2012，76（2）：257-263.

［19］钟梅芳，胡金家，丁文龙，等.胰岛素对糖尿病大鼠阴茎内nNOS神经纤维的影响［J］.中国男科学杂志，2007，21 （5）：15-18.

［20］李小鑫，邱雪锋，解吕中，等.褪黑素抗氧化治疗糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍的研究［J］.现代泌尿外科杂志，2013，18（5）：471-474.

《中国医药科学》杂志征订启事

《中国医药科学》杂志是国家卫生和计划生育委员会主管，海峡两岸医药卫生交流协会和二十一世纪联合创新（北京）医药科学研究院主办的综合性医药科技期刊，国内统一刊号：CN 11-6006/R，国际标准刊号：ISSN 2095-0616，邮发代号：82-519。现已被中国知网、中国学术期刊网络出版总库、《中国学术期刊（光盘版）》全文检索系统、万方数据数字化期刊群、中国核心期刊（遴选）数据库、中文科技期刊数据库、解放军医学图书馆CMCC和CMCI全文收录，系中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊。

全国各地邮局均可订阅，脱订者可直接通过发行部订阅。每月出版2期，每期定价20元，订阅全年24期优惠价360元。国内外公开发行，本刊设有封面人物、业界关注、专家论坛、基础医学、药物研究、论著、综述、药理与毒理、临床研究、药物与临床、影像与介入、麻醉与镇痛、医学检验、临床病理、中医中药、医药教育、经营管理等栏目。内容涉及国内外医疗、教学、科研和管理工作者在医药科研领域中所取得的新理论、新成果、新经验、新技术、新方法。欢迎内科、外科、口腔科、耳鼻咽喉科、眼科、麻醉科、皮肤科和妇产科等相关专业的科研、教学、临床和护理人员订阅与投稿。本刊为半月刊，稿件容量大、审稿专家多、编辑效率高、处理稿件快和发稿周期短。根据全国继续医学教育委员会《继续医学教育学分授予与管理办法》的规定，在本刊发表论文可获得国家级继续医学教育学分。凭订阅单复印件投稿，同等条件优先录用。欢迎各医药单位、院校、厂家刊登产品和广告。

地 址：北京市朝阳区百子湾西里402号楼1004室《中国医药科学》杂志社发行部

邮 编：100124 电 话：010-59693870-8017 传 真：010-59693848

联系人：缐红宇 联系信箱：zgyykxhrd@163.com 网 址：www.zgyykx.com

The exPression analysis of AGEs and iNOS in Penile tissue of rats with diabetes mellitus

YANG Chao1DING Yong-xue1KONG Chui-ze2LIU Xiao-wu2ZHANG Ge-jun2
1.Department of Urology，Liaoyang Central Hospital in Liaoning Province，Liao yang 111000，China；2.Department of Urology，the First Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110000，China

Objective To study the change of the expressions of advanced glycation end products（AGEs）and inducible nitric oxide synthase （iNOS）in penile tissue of rats with diabetes mellitus and the relationship of the expressions of AGEs and iNOS.Methods 64maleWistar ratswere distributed randomly into the diabeticmodel group（the DM group）and the control group （the NC group），and therewere 32rats in each group.After 4，8，12 and 20 weeks DM models being successfully prepared，8 rats in both groupswere killed.Change of the expression and localization of AGEs and iNOS in penile tissuewere observed and its change of contentwas analyzed by immunohistochemicalmethod，and the expression of AGEs and iNOSmRNA in penile tissue was detected by Real-time PCR.Results A large number of AGEs and iNOSpositive cells appeared in the penile tissue of themodel ratswith diabetes mellitus at 4，8，12 and 20 weeks respectively，the integrated option density （IOD）of these cellswere higher than those of the cells in the control group and the IOD value gradually degraded with the progression of disease （P＜0.05，P＜0.01）.Real-time PCR results show that after 4，8，12 and 20 weeksmodeling，there was no statistical difference of the AGEs and iNOSexpression of rats in NC group （P＞0.05），and the AGEs and iNOSmRNA expression level increased in penile tissue of DM model rats（P＜0.01），and its expression level was higher than the same time point of the NC group （P＜0.01）.Pearson correlation analysis showed there was a positive relationship of the expression level of AGEswith that of iNOS （r=0.845，P＜0.01）.Conclusion The expressions of AGEs and iNOS of penile tissue are markedly increased and closely correlated with each other in the status of high blood sugar and theymight collectively participate in the occurrence of penis injury in diabetes mellitus.

Diabetes mellitus；Penile tissue；Advanced glycation end products；Inducible nitric oxide synthase；Rat

R332

A

1674-4721（2015）02（c）-0008-05

2015-01-15本文编辑：许俊琴）