天麻粉水浸出物抑制油酸诱导的HL-7702细胞三酰甘油蓄积的实验研究

左增艳 于 滨 耿雅娜 孔维佳

中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050

天麻粉水浸出物抑制油酸诱导的HL-7702细胞三酰甘油蓄积的实验研究

左增艳 于 滨 耿雅娜 孔维佳▲

中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050

目的研究天麻粉水浸出物抑制油酸（OA）诱导的HL-7702细胞三酰甘油（TG）蓄积的作用及相关细胞信号通路。方法以1 mmol/L的OA诱导细胞脂肪变性，同时加入不同浓度的天麻粉水浸出物共同孵育24 h后测定细胞内TG含量。在Western blot实验中，细胞以天麻粉水浸出物做相应处理后检测AMP活化蛋白激酶α（AMPKα）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化水平。在使用compound C的实验中，细胞以10 μmol/L的compound C预处理30 min，然后加入天麻粉水浸出物，共同孵育8 h后进行Western blot实验；或加入OA+天麻粉水浸出物，共同孵育24 h后测定细胞内TG含量。结果OA孵育24 h后，HL-7702细胞内TG含量较对照细胞升高约（4.0±0.5）倍（P＜0.01），天麻粉水浸出物使细胞内TG呈剂量依赖性降低。天麻粉水浸出物处理后能剂量和时间依赖性地激活HL-7702细胞的AMPK信号通路，表现为磷酸化AMPKα（p-AMPKα）和磷酸化ACC（p-ACC）的水平显著增加。compound C预处理并与天麻粉水浸出物共同孵育后能完全阻断后者对AMPK通路的激活作用以及减少细胞内TG的药效。结论天麻粉水浸出物能显著抑制OA诱导的HL-7702细胞三酰甘油蓄积，此作用依赖于细胞内AMPK通路的激活。

天麻粉；水浸出物；HL-7702细胞；油酸；三酰甘油；AMP活化蛋白激酶

天麻（Gastrodia elata）又名“赤箭”，为兰科植物，在我国有悠久的药用历史。其味甘，入肝经，目前临床上主要用于治疗癫痫、眩晕等神经系统疾病［1］。天麻及其主要有效成分天麻素对代谢性疾病有一定疗效，如有报道天麻粉和天麻素在高血脂金黄地鼠、大鼠和小鼠等模型中具有明显的降脂和减肥作用［2-5］；天麻粉还能显著减轻大鼠肝脏脂肪蓄积并改善其肝功能［6］；在临床研究中，天麻细粉片具有一定辅助降血脂作用，并且无不良反应［7］。笔者实验室最近的研究工作表明，天麻素减少肝细胞脂肪蓄积的机制与AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路的激活有关［8］。AMPK是细胞和组织中的能量感受分子，参与调控能量和物质代谢［9］。天麻粉抑制肝脏脂肪蓄积的机制尚不明确，本研究利用油酸（oleic acid，OA）诱导的方法建立了体外肝细胞脂肪变性模型，并研究天麻粉水浸出物减少三酰甘油（triglyceride，TG）蓄积的药效和对AMPK的激活作用。

1 材料与方法

1.1 材料

天麻粉由全天麻烘干超微粉碎而制成，由陕西汉王略阳中药科技有限公司提供，批号为T01-110714。HL-7702细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所并在本研究室冷冻保存。细胞培养试剂如DMEM培养液和胎牛血清（FBS）购自Invitrogen公司，OA和compound C购自Sigma-Aldrich公司。TG测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。单克隆抗体包括β-actin、AMPKα、磷酸化AMPKα（p-AMPKα）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和磷酸化ACC（p-ACC）均购自Santa Cruz公司，Mammalian Protein Extraction Reagent购自Thermo Fisher公司，PVDF膜和ECL试剂盒购自Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 天麻粉水浸出物的制备［10］称取天麻粉5 g，加入去离子水100 ml（重量体积比为50 mg/ml），于室温搅拌浸提24 h。粗滤后以0.22 μm的针头滤器（Millipore公司）过滤除菌备用。

1.2.2 细胞培养HL-7702细胞培养于含10％FBS和适当抗生素的DMEM培养液中。每次实验前待细胞生长至约70％融合，弃去原培养液，将细胞置于含0.5％FBS的培养液中，饥饿24 h后进行处理。

1.2.3 细胞处理在TG测定实验中，细胞以浓度为1 mmol/L的OA［8］处理24 h诱导脂肪变性，同时加入浓度为0、100、200、500、1000 μg/ml的天麻粉水浸出物共同孵育。在免疫印迹（Western blot）实验中，细胞血清饥饿后以浓度为0～1000 μg/ml的天麻粉水浸出物处理8 h或以500 μg/ml的天麻粉水浸出物处理0～12 h。在使用compound C的实验中，细胞不予处理或以10 μmol/L的compound C［8］预处理30 min，其后继续不予处理或加入浓度为500 μg/ml的天麻粉水浸出物，共同孵育8 h后进行Western blot实验。在另一组实验中，细胞以或不以compound C预处理后，除对照组外，所有细胞均加入1 mmol/L的OA，同时加入或不加入500 μg/ml的天麻粉水浸出物，共同孵育24h后测定细胞内TG含量。以上所有实验均重复3次。

1.2.4 细胞内TG含量测定［8］细胞处理后收集细胞，以冻融法裂解后收集上清测定TG浓度，细胞内TG含量以μmol/g蛋白表示。

1.2.5 Western blot实验［8］细胞处理后浸出总蛋白，以8％分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜并封闭后依次与β-actin、p-AMPKα和p-ACC等抗体孵育，洗膜后与二抗孵育并显色。然后利用Stripping buffer（Santa Cruz公司）将膜上结合的抗体洗脱后重新与AMPKα和ACC抗体进行孵育检测其总表达。以Gel-PRO ANALYZER凝胶分析软件（Media Cybernetics公司）定量分析蛋白条带并计算p-AMPKα/ AMPKα和p-ACC/ACC的比值，以百分数表示。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天麻粉水浸出物对OA孵育的HL-7702细胞内TG含量的影响

如图1所示，OA孵育24 h后，HL-7702细胞内TG含量较对照细胞升高约（4.0±0.5）倍（P＜0.01）；天麻粉水浸出物与OA共同孵育使细胞内TG呈剂量依赖性降低。浓度为100 μg/ml的天麻粉水浸出物处理24 h可使细胞内TG降低，平均下降（18.5±2.4）％，与单加OA细胞比较差异有统计学意义（P＜0.05）；1000 μg/ml的天麻粉水浸出物可使细胞内TG平均降低（39.2±5.1）％，与单加OA细胞比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 天麻粉水浸出物对OA孵育的HL-7702细胞内TG含量的影响与对照细胞比较，***P＜0.01；与单加OA细胞比较，#P＜0.05、##P＜0.01

2.2 天麻粉水浸出物激活HL-7702细胞的AMPK信号通路

如图2所示，天麻粉水浸出物处理HL-7702细胞后能激活其AMPK信号通路，表现为p-AMPKα及其下游分子p-ACC的水平显著增加。天麻粉水浸出物对AMPK通路的作用具有剂量依赖性（图2A），浓度为100 μg/ml的天麻粉水浸出物处理8 h使细胞内的p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC的比值增加，分别平均增加（0.50±0.06）和（0.43±0.05）倍，与对照细胞比较差异有统计学意义（P＜0.05）；1000 μg/ml的天麻粉水浸出物使细胞内p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ ACC比值较对照细胞分别平均增加（1.32±0.17）和（1.38±0.19）倍（P＜0.01）。天麻粉水浸出物对AMPK通路的作用也具有时间依赖性（图2B），浓度为500 μg/ml的天麻粉水浸出物处理1 h使HL-7702细胞的p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC比值较对照细胞增加，分别平均增加（1.05±0.12）和（1.11±0.13）倍，（P＜0.01），且药物作用至少维持12 h。

图2 天麻粉水浸出物对HL-7702细胞AMPK通路的剂量（A）和时间（B）依赖性的激活作用与对照细胞比较，*P＜0.05、**P＜0.01

如图3所示，HL-7702细胞单加compound C可使p-AMPKα和p-ACC的基础水平下降，与对照细胞比较差异有统计学意义（P＜0.05）。浓度为500 μg/ml的天麻粉水浸出物处理8 h可使细胞内p-AMPKα/ AMPKα和p-ACC/ACC比值较对照细胞分别平均增加（1.28±0.17）和（1.24±0.13）倍（P＜0.01）；10 μmol/L的compound C预处理30 min并与天麻粉水浸出物共同孵育后能完全阻断后者对AMPK通路的激活作用，使p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC比值降低到对照细胞的基础水平，与单加天麻粉水浸出物的细胞比较差异有统计学意义（P＜0.01）。以上结果证明天麻粉水浸出物在HL-7702细胞中能激活AMPK信号通路，且其药效能被compound C阻断。

2.3 天麻粉水浸出物抑制HL-7702细胞内TG蓄积作用依赖AMPK通路的激活

如图4所示，单加compoundC对OA诱导的HL-7702细胞TG蓄积没有任何作用，浓度为500 μg/ml的天麻粉水浸出物与OA共同孵育24 h后可使细胞内TG平均降低（40.8±4.5）％，与单加OA细胞比较差异有统计学意义（P＜0.01）。10 μmol/L的compound C预处理30 min并与OA+天麻粉水浸出物共同孵育24 h后能完全阻断天麻粉水浸出物减少细胞内TG的药效，其与OA+天麻粉水浸出物处理的细胞比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3 compound C阻断天麻粉水浸出物对HL-7702细胞AMPK通路的激活作用与对照细胞比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与单加天麻粉水浸出物细胞比较，##P＜0.01

图4 compound C阻断天麻粉水浸出物减少OA诱导的HL-7702细胞TG蓄积的作用与对照细胞比较，***P＜0.01；与单加OA细胞比较，##P＜0.01；与OA+天麻粉水浸出物处理的细胞比较，△△P＜0.01

3 讨论

本研究首次报道，天麻粉水浸出物对肝细胞AMPK的激活作用。由于AMPK主要参与调控能量代谢和物质代谢，是治疗代谢性疾病包括血脂紊乱、非酒精性脂肪肝、糖尿病和肥胖症等的重要分子靶点［9］，因此天麻粉水浸出物对AMPK的激活作用可部分解释其降血脂、减肥和减轻动物肝脏脂肪蓄积的药效［2-7］。

中药的生产和处理方法会对其药效产生很大的影响［10-11］。由于天麻粉的主要有效成分如天麻素等易溶于水［1］，在本研究中，笔者采用水浸提的方法来处理天麻粉。有文献报道［12］，天麻粉经去离子水超声浸出并浓缩后从其组分中鉴定出20多种化合物，其中包括天麻素以及多种醛类、酚类和糖苷等，与其他文献［13］报道天麻的成分相吻合。本研究中天麻粉水浸出物中主要成分是什么以及比例尚需深入研究，另外上述成分中除天麻素外其他物质对AMPK是否有激活作用也值得进一步研究。

除常温水浸出之外，也有报道采用水煎［14］和乙醇浸出［15］等工艺来处理天麻。其中有报道天麻水煎剂对醋氨酚所致小鼠肝脏损伤有一定保护作用［14］。不同处理工艺是否对天麻的AMPK激活作用有影响需进一步研究。

笔者在之前的研究工作中同时采用天麻粉和天麻素来治疗金黄地鼠的高脂血症并观察到良好的疗效，其中天麻粉的最大剂量（500 mg/kg）为天麻素最大剂量（50 mg/kg）的10倍［2］。在本研究中，天麻粉水浸出物的最高浓度（1000 μg/ml）也被设计为先前报道［8］天麻素最高浓度（338.7 μmol/L，相当于100 μg/ml）的10倍。

综上所述，本研究揭示了天麻粉水浸出物通过激活AMPK通路来抑制OA诱导的HL-7702细胞TG蓄积的药理作用。另有文献报道，天麻和天麻素具有降糖作用［4，16-17］，而AMPK是调节肝脏、肌肉和脂肪组织胰岛素敏感性的主要分子［9，18-20］，因此天麻是否具有胰岛素增敏作用及对肌肉和脂肪组织的AMPK是否有激活作用也是有意义的研究课题。

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Experimental study of inhibitory effect of Gastrodia powder aqueous extract on oleic acid-induced triglyceride accumulation in HL-7702 cell

ZUO Zeng-yan YU Bin GENG Ya-na KONG Wei-jia▲
Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100050，China

Objective To study the inhibitory effect of Gastrodia powder aqueous extract on oleic acid（OA）-induced triglyceride（TG）accumulation in HL-7702 cell and related cellular signaling pathway.Methods 1 mmol/L of OA was used to induce cellular steatosis，Gastrodia powder aqueous extract at different concentrations were added and incubated together for 24-h for determination of intracellular TG content.In Western blot experiment，cells were treated with Gastrodia powder aqueous extract as indicated，phosphorylation level of AMP-activated protein kinase α（AMPKα）as well as acetyl coA carboxylase（ACC）were determined.In experiment using compound C，cells were pretreated with 10 μmol/L of compound C for 30-min and then Gastrodia powder aqueous extract was added.After 8-h of incubation，Western blot was performed.Alternatively，the cells were treated with OA+Gastrodia powder aqueous extract for 24 h after compound C pretreatment，intracellular TG contents were then assayed.Results Compared with that of control cell，the intracellular TG content increased for about（4.0±0.5）fold in HL-7702 cell after 24-h of OA incubation（P＜0.01）.Gastrodia powder aqueous extract could decrease intracellular TG in a dose-dependent manner.Administration of Gastrodia powder aqueous extract could activate the AMPK pathway dose and time dependently in HL-7702 cell，as indicated by the obvious increase of phosphorylated AMPK α（p-AMPKα）as well as phosphorylated ACC（p-ACC）level.When the cells were pretreated with compound C and incubated with Gastrodia powder aqueous extract，the stimulating activity of Gastrodia powder aqueous extract on AMPK pathway and its reducing effect on intracellular TG accumulation were completely blocked.Conclusion Gastrodia powder aqueous extract inhibits OA-induced TG accumulation greatly in HL-7702 cell，and this inhibitory effect depends on the activation of AMPK pathway in cells.

Gastrodia powder；Aqueous extract；HL-7702 cell；Oleic acid；Triglyceride；AMP-activated protein kinase

R965

A

1674-4721（2015）05（a）-0012-05

2015-01-16 本文编辑：李亚聪）

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目（IMBF20060505）

左增艳（1962-），女，副主任技师，主要研究方向：微生物与生化药学

▲通讯作者