四逆汤对脓毒症中晚期大鼠心肌细胞的保护作用*

韩云　谢东平　赖芳　杨卫立　林熙泉

（广东省中医院芳村医院，广东广州510145）

·研究报告·

四逆汤对脓毒症中晚期大鼠心肌细胞的保护作用*

韩云谢东平赖芳杨卫立林熙泉

（广东省中医院芳村医院，广东广州510145）

目的观察四逆汤对脓毒症中晚期大鼠心肌损伤的保护作用。方法雄性SPF级大鼠70只，随机分为正常对照组、脓毒症模型组、四逆汤低剂量组和高剂量组。采用盲肠结扎穿孔制作脓毒症中晚期大鼠模型。治疗组在造模后72 h进行干预，观察各组大鼠造模后第7日存活率，对存活大鼠进行腹主动脉取血，测定血清TNF-α、IL-10及cTnT水平，处死大鼠后采集心肌组织，应用TUNEL法进行心肌细胞凋亡检测。结果经四逆汤干预治疗后，模型组与四逆汤高、低剂量治疗组第7日存活率差异无显著意义（P＞0.05），但治疗组大鼠血清TNF-α、IL-10及cTnT较正常对照组出现不同程度下降。四逆汤高、低剂量治疗组心肌细胞凋亡率较模型组明显下降（P＜0.05），但高剂量组与低剂量组之间心肌细胞凋亡率无显著差异（P＞0.05）。结论四逆汤可减轻心肌细胞损伤，延缓心肌细胞凋亡，其机制可能与改善脓毒症晚期大鼠免疫功能状态，抑制炎症介质的释放有关。

脓毒症心肌功能障碍心肌凋亡四逆汤

脓毒症性心肌功能障碍（SIMD）是脓毒症性休克持续难以纠正，并导致患者最终死亡的重要原因［1］。目前对于脓毒症性心肌功能障碍机制尚未完全明确，国外研究显示脓毒症能诱导大鼠心肌细胞凋亡，早期（1～3 d）即开始出现心肌细胞损伤，而且该效应在脓毒症中、晚期（3～7 d）更加明显，其机制可能与肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎症介质启动内、外源性细胞凋亡通路有关［2］。四逆汤是中医治疗阳气外脱证的代表方，具有强心、抗休克、改善心肌缺血等多种药理作用，既往的研究发现四逆汤能够有效改善缺血再灌注引起的心肌凋亡，抑制内毒素引起的炎症介质过度释放［3-5］。本研究拟建立SIMD大鼠模型，观察四逆汤对SIMD大鼠模型的影响，并重点从炎症介质、心肌凋亡角度探讨其可能的细胞分子机制，为进一步开发四逆汤，应用四逆汤类方干预脓毒症性休克、SIMD提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与试剂SPF级SD雄性大鼠70只，体质量（350±30）g，由广东省动物实验中心提供，合格证号为0068998和0072254。四逆汤煎剂由熟附子、干姜、炙甘草按照3∶2∶2的比例浓煎成含原生药1 g/mL，过滤除菌分装-20℃保存备用。主要试剂：大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（武汉博士德公司，产品编号：EK0418）；大鼠白介素10（IL-10）ELISA检测试剂盒（武汉华美公司，产品编号：CSB-E07972r）；大鼠心肌肌钙蛋白T（CTnT）ELISA检测试剂盒（武汉华美公司，产品编号：CSB-E11305r）；TUNEL试剂盒：（In Situ Cell Death Detection Kit，POD（Cat.No.11684817910，ROCHE公司）。

1.2分组与给药按随机数字表法随机将实验动物分为4组：正常对照组）、脓毒症模型组、四逆汤低剂量治疗组、四逆汤高剂量治疗组。正常空白组10只，其余每组20只。四逆汤组自造模72 h后开始给药干预，低剂量组按原生药3 g/d予四逆汤灌胃；高剂量组则按原生药6 g/d给药。正常对照组及模型组则每日灌服3 mL生理盐水。

1.3模型制备参考文献［6］采用CLP造模。大鼠适应环境1周，术前禁食12 h；以10%水合氯醛（0.3 mL/ 100 g）经腹腔注射麻醉后，沿腹前正中线切开2 cm，游离肠系膜和盲肠，以3-1丝线环形结扎盲肠根部，结扎完毕保证肠道通畅后，在盲肠肠壁上穿刺2下，造成2个瘘口，轻轻挤压肠管使粪便自穿刺口溢出，还纳肠管，逐层缝合关腹。术毕腹壁皮下注射生理盐水3 mL/ 100 g。术后自由进水进食。

1.4标本采集及检测造模后第7日对所有存活大鼠予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射进行麻醉，经腹主动脉采血，按照cTnT、TNF-α以及IL-10 ELISA检测试剂盒说明书方法对以上指标进行检测；处死大鼠后采集左心室心肌组织，按照TUNEL试剂盒说明书方法进行细胞凋亡检测。

1.5统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，计量资料组间比较采用t检验，方差不齐者采用秩和检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1生存分析模型组第7日存活大鼠6只，存活率为30%；四逆汤低剂量组第7日存活大鼠10只，存活率为50%；四逆汤高剂量组第7日存活大鼠11只，存活率为55%。四逆汤两组分别与模型组比较，存活率差异无统计学意义（P＞0.05）；A、B两组间比较，各组大鼠存活率差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2四逆汤对脓毒症中晚期大鼠血cTnT、TNF-α、IL-10水平的影响见表1。模型组，四逆汤高、低剂量组大鼠血清cTnT、TNF-α、IL-10明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，四逆汤组大鼠血cTnT、TNF-α、IL-10水平有明显下降（P＜0.05），但四逆汤两组间cTnT、TNF-α、IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　各组大鼠血清cTnT、TNF-α和IL-10水平比较（pg/mL，±s）

表1　各组大鼠血清cTnT、TNF-α和IL-10水平比较（pg/mL，±s）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别nIL-10 cTnTTNF-α正常对照组10153.5±59.58模型组6707.17±94.41*四逆汤高剂量组10267.5±76.41*△722.27±426.66652.68±208.35 4678.05±1391.71*2080.79±338.75*1397.48±519.78*△1053.85±191.32*△四逆汤低剂量组11251.66±101.31*△1161.17±393.74*△997.51±205.40*△

2.3四逆汤对脓毒症中晚期大鼠心肌凋亡的影响见表2和图1。模型组、四逆汤两组大鼠心肌细胞凋亡率明显高于正常对照组（P＜0.05）；经四逆汤干预后，四逆汤两组心肌细胞凋亡率较模型组有明显下降（P＜0.05），但四逆汤两组间心肌细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　各组大鼠心肌细胞凋亡率比较（%）

图1　TUNEL检测脓毒症大鼠心肌细胞凋亡（400倍）

3　讨论

脓毒症性休克发展迅速，预后极差，而脓毒症性心肌功能障碍是导致脓毒症性休克患者死亡的重要原因［1］。国外研究指出脓毒症大鼠普遍存在心肌功能障碍的情况，尤其是晚期脓毒症大鼠心肌功能障碍更加明显［7］。国内学者研究指出脓毒症大鼠早期开始出现心肌损伤，到72 h左右心肌损害标志物水平达到高峰［8］。以上文献结果均提示心肌细胞的凋亡有可能是脓毒症大鼠中、晚期出现心肌功能障碍的重要原因。故本研究采用中、晚期（3～7 d）作为干预时点进行疗效评价。

CLP方法为复制脓毒症模型的经典方法。本研究所制备CLP模型各组3天死亡率均接近50%，与文献［7］所显示死亡率相接近，且目前文献所显示的心肌损伤高特异性指标如CTnT［9］以及直接反应心肌损伤程度的心肌细胞凋亡率均在造模后较空白对照组明显升高（P＜0.05），与张东等［10］近期就脓毒症肌钙蛋白变化结果相接近，以上均提示采用CLP造模后大鼠存在明显的心肌损伤，符合本研究的要求，故该脓毒症模型可用于脓毒症心肌保护的研究。

脓毒症早期属于中医学“毒热症”、“肺热病”等范畴，病理机制以实证、热证为主；当而疾病继续发展其病机逐渐由“闭”向“脱”方向发展，后期一般都表现出阳气虚衰、心阳不振的证候特点，故晚期脓毒症多归于“脱证”范畴。四逆汤是治疗一切阳气虚衰证的代表方，符合脓毒症中、晚期的辨证施治原则。目前国内文献提示四逆汤在抗缺血再灌注损伤引起心肌损伤方面有较显著的疗效［3-4］，且还对二次打击所造成的MODS大鼠具有免疫调节以及抗氧化作用［11］，故使用四逆汤对中晚期脓毒症进行干预符合现代医学病理生理学观点。本研究结果显示经过四逆汤干预后，高、低剂量治疗组cTnT水平以及心肌细胞凋亡率均较模型组明显下降，说明四逆汤能减轻中晚期脓毒症心肌损伤。

对于SIMD，目前基础研究认为其可能机制主要为各种因素导致心肌细胞功能性抑制和心肌细胞实质性损害［7，12］。而且肿瘤坏死因子、一氧化氮等炎症介质的启动内、外源性心肌细胞凋亡通路加快细胞凋亡的学说逐渐被基础研究所验证［2］。故在现有研究指导下学者们逐渐把抑制炎症介质、延缓心肌细胞凋亡作为保护脓毒症心肌功能障碍的重点研究方向。现有研究指出TNF-α是脓毒症发展过程中的中心介质之一，可通过多种机制造成心肌损伤［13］。而IL-10是人类最强的抗炎介质，研究显示严重脓毒症IL-10水平与其病情相平行［14］，说明脓毒症晚期存在严重免疫功能紊乱状态，促炎、抗炎介质大量释放。本实验结果显示模型组血清TNF-α和IL-10均较正常组明显升高，进一步验证前面文献所指出的免疫紊乱状态的观点。经四逆汤干预后TNF-α、IL-10均出现显著性下降。说明四逆汤在平衡中晚期脓毒症大鼠炎症、抗炎反应，纠正免疫功能紊乱方面起到一定的作用。

综上所述，本研究在CLP脓毒症大鼠模型上观察到中晚期脓毒症大鼠存在严重的免疫功能紊乱以及明显的心肌损伤和心肌细胞凋亡加速。经过四逆汤干预后大鼠促炎、抗炎反应均出现不同程度的减退，而且心肌损伤程度下降、心肌细胞凋亡延缓。故四逆汤具有减轻心肌细胞损伤，延缓心肌细胞凋亡的作用，其机制有可能与其纠正中晚期脓毒症大鼠免疫功能紊乱有关。

［1］Levy RJ，Deutschman CS.Evaluating myocardial depression in sepsis［J］.Shock，2004，22：1-10.

［2］Avadhesh C.Sharma.sepsis-induced myocardial dyscardial dysfuntion［J］.Shock，2007，28（3）：265-269.

［3］刘颖，吴伟康，陈晨，等.四逆汤预防性给药抗心肌细胞凋亡的作用机制探讨［J］.中国中药杂志，2006，31（l5）：1269-1272.

［4］刘颖，陈晨，吴伟康，等.四逆汤诱导延迟预适应抗心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的机制探讨［J］.中药材，2006，29（4）：345-348.

［5］葛迎春，刘平，马天舒，等.四逆汤类方提取物对内毒素血症大鼠血浆中PGI2、AgⅡ、IL-2和TNF含量的影响［J］.中华现代中西医杂志，2004，2（5）：385-387.

［6］Villar J，Ribeiro SP，Mullen JB，et al．Induction of the heat shock response reduces mortality rate and organ damage in a sepsis induced acute lung injury model［J］．Crit Care Med，1994，22（6）：914-921．

［7］Mani Chopra，Avadhesh C，Sharma.Distinct cardiodynamic and molecular characteristics during early and late stages of sepsis-induced myocardial dysfunction［J］.Life Sciences，2007，81：306-316.

［8］庄海舟，张淑文.中药912液对脓毒症大鼠心肌损伤保护的实验研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2008，15（1）：16-19.

［9］Mehta NJ，Khan IA，Gupat V，et al.Cardiac troponin I predicts myo-cardial dysfunction and adverse outcome in septic shock［J］.Int J Cardiol，2004，95（1）：13-17.

［10］张东，李洪祥.严重脓毒症和脓毒症休克患者心肌肌钙蛋白Ⅰ的变化及临床意义［J］.实用医学杂志，2011，27（1）：49-51.

［11］刘筱蔼，曾萍.四逆汤对多器官功能障碍综合征大鼠炎症介质和氧化应激的影响［J］.华中科技大学学报，2009，8（38）：486-490.

［12］Court O，Kumar A，Parrillo JE，et al.Myocardial depression in sepsis and septic shock［J］.Crit Care，2002，6：500-507.

［13］Prabhu SD.Cytokine-induced modulation of cardiac function［J］.C-irc Res，2004，95（12）：1140-1153．

［14］Gogos CA，Droson E，Bassaris HP，et al.Pro-versus anti-inflammator-y cytokine profile in patients with severe sepsis：A marker for p-rognosis and future therapeutic options［J］.J Infect Dis，2000．181：176-180．

Protection Effects of Sini Decoction on Cardiac Myocytes in Middle-late Stage of Sepsis Rats

HAN Yun，XIE Dongping，LAI Fang，et al.Fangcun Branch Hospital，Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine，Guangdong，Guangzhou 510145，China

Objective：To observe effects of Sini Decoction on cardiac myocytes in middle-late stage of sepsis rats.Methods：70 male SPF rats were randomly distributed into control group（10 rats），sepsis model group（20 rats），low-dose Sini Decoction treatment group（20 rats）and high-dose Sini Decoction treatment group（20 rats）. Sepsis model of rats was induced by the method of cecal ligation and puncture（CLP），and treatments were administered 72 h post-CLP.Survival rates on the 7th day post-CLP were observed.Blood samples were collected from abdominal aortas for testing the level of TNF-α，IL-10 and cTnT.Cardiac myocytes apoptotic cells were detected by TUNEL.Results：The differences in the 7 th day survival rates between sepsis model group，low-dose Sini Decoction treatment group and high-dose Sini Decoction treatment group were not significant.Significant declines were detected in TNF-α，IL-10 and cTnT level after Sini Decoction treatment（both low and high dose）.There were significant declines in both high and low dose Sini Decoction treatment groups comparing with the sepsis model group on the apoptotic rates of cardiac myocytes，but there was no significant difference when comparing between the high and low dose Sini Decoction treatment groups.Conclusion：Sini Decoction might reduce myocardial injury and delay apoptosis of cardiac myocytes in middle-late stage of sepsis rats through improving immune function and suppressing the release of inflammatory mediators.

Sepsis；Cardiac myocytes dysfunction；Cardiac myocytes apoptosis；Sini Decoction

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0027-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.009

2014-10-13）

广东省自然科学基金资助项目（9151040701000046）；广东省科技计划项目（2011B031700033）