“醒脑开窍”针刺法对脑缺血再灌注大鼠模型早期运动功能恢复及SYN表达影响的研究*

李钦潘　王伟　韩永升　汪炜民　毛玉强　郭铁　韩峰群

（安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽合肥230061）

·研究报告·

“醒脑开窍”针刺法对脑缺血再灌注大鼠模型早期运动功能恢复及SYN表达影响的研究*

李钦潘王伟韩永升△汪炜民毛玉强郭铁韩峰群

（安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽合肥230061）

目的观察“醒脑开窍”针刺法对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型早期运动功能恢复和脑内突触囊泡蛋白（SYN）表达的影响。方法健康成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组和电针对照组，每组40只。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。电针组和电针对照组针刺双侧内关、水沟、三阴交、百会，行电针治疗30 min。首次针刺在动物造模成功后24 h内进行，其后每日上午针刺1次，每7日为1疗程（针刺6 d，休息1 d）。假手术组、模型组常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗。各组大鼠在7、14 d两个时间点亚组随机取20只进行神经功能评估，然后随机各取10只进行脑梗死体积的比较和免疫组化SP法检测SYN的表达。结果电针对照组和假手术组大鼠无神经功能缺损症状，7、14 d时电针组大鼠神经功能恢复明显优于模型组。TTC法染色后电针对照组和假手术组未见脑梗死灶，电针组脑梗死体积明显小于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫组化SP法检测电针对照组和假手术组可见少量SYN的表达，模型组大鼠脑梗死后两个时间点脑缺血周围出现SYN表达增多，与假手术组比较均有极显著差异（P＜0.01），电针组SYN表达在两个时间点较模型组增加更明显（P＜0.05）。结论“醒脑开窍”针刺法能促进大鼠局灶性脑梗死后的神经运动功能恢复，其机制可能与促进脑局灶性缺血再灌注大鼠脑内SYN的表达，提高神经可塑性有关。

“醒脑开窍”针刺法脑缺血再灌注运动功能SYN神经可塑性

缺血性脑血管病由于其高发病率、患病率、致残率、复发率和死亡率，已经成为威胁人类健康的重大疾病［1］。因此进一步加大防治力度，预防脑血管病的并发症，改善脑血管病的预后，提高脑血管病的疗效已成为当前一项刻不容缓的重务。目前关于缺血性心血管病（ICVD）的治疗仅有t-PA具有循证医学的证据，而且迄今为止仅有3%～5%的急性缺血性脑卒中患者得到t-PA的治疗［2］。在溶栓治疗方面，也使用神经保护剂来保护脑组织免受或减轻再灌注损伤，但尚无一种神经元保护药物让临床ICVD患者从中获益［3］。而研究证实针刺在ICVD的应用优势独特［4］，已经成为中风的常规治疗方法［5］。本研究主要通过针刺干预脑缺血再灌注大鼠模型，从神经可塑性探讨大鼠运动功能的恢复，为针刺治疗缺血性脑血管病提供新的理论和实验依据。

1　材料与方法

1.1动物分组选择18月龄，雄性老年，体质量250～300 g的SD大鼠160只（购自合肥白湖博源实验动物繁殖中心），饲养于安徽中医药大学实验动物中心。喂养鼠用清洁级颗粒饲料，动物自由取水，视垫料的清洁度更换垫料。饲料、垫料均购自于合肥白湖博源实验动物繁殖中心，饲养环境温度24～28℃，相对湿度45%～65%，光照12 h，通风良好。动物随机分为假手术组（只做血管分离）、模型组、电针组、电针对照组，每组40只。根据治疗天数7 d、14 d，随机又分为2个亚组，每亚组各20只。

1.2仪器与试剂G6805电针仪（苏州医疗用品厂有限公司）；TB-71SS生物组织自动包埋机（湖北孝感市泰维电子设备有限公司）；2135切片机（德国Leica）；HPX-9052数显电热培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备）；DP70数码图像装置（日本奥林巴斯）；捷达JD801图像分析系统（江苏捷达科技有限公司）；Synaptophysin Polyclonal Antibody（批号17785-1-AP，美国GBI公司）；照相机（日本尼康）；PBS（北京中杉金桥生物技术有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氯唑（TTC）（Sigma公司）

1.3模型制备在室温22℃条件下，SD大鼠称质量后，参考Zea Longa方法［6］，制备急性缺血性脑血管病动物模型。电针对照组不进行任何手术处理，假手术组只分离动脉，不结扎、插线。大鼠苏醒后参照Zea Longa［6］方法评分：0分为无神经系统症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为爬行时转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自行行走，意识丧失。达到1～3分为造模成功。因本实验模型成功率低，动物死亡率又高，采用差额补充的方法以保证每组的实验例数。

1.4干预方法电针组：造模成功后用自制鼠夹固定，不麻醉。根据华兴邦等［7］制定的大鼠针灸穴位图谱，主穴双侧内关、水沟、双侧三阴交、百会。采用苏州生产的华佗牌毫针，规格为直径0.2 mm，针身0.5寸。选用“醒脑开窍”针刺法进行针刺：先直刺双侧内关1 mm至筋间，用捻转提插结合的泻法，持续1 min留针30min；继刺水沟，在鼻中隔下部向上斜刺水沟1mm，施雀啄法强刺激1 min，其次刺三阴交，直刺5 mm，采用提插补法刺激1 min；最后向前或向后斜刺百会穴2 mm，并采用平补平泻的捻转手法，转角度180°左右，施手法1 min，留针30 min，留针期间将内关、三阴交穴位针刺针柄分别连接至G6805电针仪，施以疏密波，频率2/100 Hz，电压2～4 V，强度逐渐加大到模型鼠针刺部位轻微抖动为度。首次针刺在造模成功后24 h内进行，其后每天上午针刺1次，每7日为1疗程（针刺6 d，休息1 d）。电针对照组：不进行任何手术，抓取、固定方法、针刺穴位、方法、频率、电针刺激参数等同电针组。假手术组和模型组：常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗。

1.5标本采集各组大鼠分别于7 d、14 d，两个时间点各亚组随机取10只。用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后固定于手术台，剪开胸腔，暴露心脏，用9号针头插入左心室，待右心耳膨起剪开右心耳让血液流出，灌注4℃生理盐水，至大鼠口中流出无色液体时开始用4%的多聚甲醛灌注固定，灌注过程中会发现甲醛滴速由快变慢，大概灌注30 min左右时大鼠身体及内脏基本僵硬，然后立即剖颅取出完整大脑，取出的脑组织放置于冰的生理盐水中洗去残余的血水（以减少残余血水对实验结果的影响），然后放置于4%的多聚甲醛中保存（6～24 h）备用，行免疫组化检测。每个亚组剩下的10只剖颅取脑后，从视交叉处切开，冠状切取2 mm包括梗死灶区域和左右半球的脑组织，然后放置于冰箱中冷冻15 min左右，基本变硬后切片行氯化三苯基四氯唑（TTC）染色。注意试验过程中要严格无菌消毒，取脑组织时动作要轻柔、迅速，切勿强行牵拉而破坏脑组织的完整性。

1.6指标检测

1.6.1神经功能评定参照Zea Longa［6］神经功能评分标准评分。在模型制作成功第7、14日分别进行神经功能评分，观察其运动功能恢复的情况。

1.6.2脑组织HE病理染色大鼠脑组织石蜡包埋固定、切片，切片厚度4 μm，切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，然后将切片置于苏木素轻度复染8 min，自来水冲洗去多余染料，1%盐酸乙醇分化数秒，水洗1 min，然后置于PBS溶液中蓝化，至细胞核变蓝，再置于1%伊红水溶液中浸泡2 min，梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后用中性塑胶封片，晾干后，用OLYMPUSDP70数码图像装置拍摄10×40倍镜下选取的同张片子的5个不同视野的图片，最后采用捷达JD801图像分析系统分析。

1.6.3TTC染色后计算实验SD大鼠脑组织梗死体积从冰箱中取出脑组织，置于体积分数2%的2.3.5-TTC中，组织要完全被TTC液覆盖，在37℃下避光染色30 min，期间15 min后翻动1次，以便组织两面都能完全着色。正常脑组织被染成红色，坏死组织不着色。再用体积分数4%的多聚甲醛固定后使用1000万像素以上数码相机照相，使用捷达JD801图像分析系统计算脑梗死体积，采用梗死率表示梗死体积：梗死率（100%）=微梗死体/总体积×100%=（S1+S2+S3+…+Sn）H/（S1总+S2总+S3总+…+Sn总）H，S表示每片的梗死面积，H表示每片厚度。

1.6.4免疫组化检测突触囊泡蛋白（SYN）在大鼠脑组织的表达：（1）脑组织石蜡包埋，经常规切片、60℃水中摊片、粘片、65℃烘片6 h后脱蜡脱水，然后经各级乙醇至水洗；（2）热修复抗原：微波炉中以最大微波火力加热110 s，然后以最小微波火力加热8 min，室温自然冷却；（3）置于3%H2O2去离子水20 mL孵育6 min，以消除内源性过氧化物酶，自来水洗2 min；（4）将玻片铺于湿盒内，PBS冲洗两遍，甩干，在组织周围用“SUPER PAP PEN”画一圈，将一抗（1∶50稀释）滴于组织上覆盖组织，然后在湿盒内加水盖盖，4℃冰箱过夜；（5）取出湿盒复温30 min，PBS冲洗两遍，甩干，然后滴加DAB显色液，显微镜下观察2～5 min，显色后，自来水洗涤终止反应，水洗2 min；（6）苏木素轻度复染4 min，水洗去多余的染料，1%盐酸乙醇溶液中分化数秒，水洗1 min，然后置于PBS溶液中蓝化；（7）梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；（8）OLYMPUSDP70数码图像装置下观察、摄片，捷达JD801图像分析系统对SYN表达进行分析。

1.7统计学处理应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用one way ANOVA分析，方差齐性采用LSD法两两比较，不齐时采用Dunnett′s法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠神经功能评分比较见表1。电针对照组和假手术组大鼠未见神经功能缺损症状。模型组和电针组比较，造模成功后7 d、14 d时，电针组大鼠神经功能恢复明显优于模型组（P＜0.05）。

表1　各组大鼠不同时间点神经功能评分比较（分，±s）

表1　各组大鼠不同时间点神经功能评分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别n14 d 24 h7 d电针对照组200假手术组200模型组201.61±0.36*0 0 0 0 2.75±0.50*2.26±0.61*电针组201.08±0.29*△△2.32±0.57*△1.57±0.57*△△

图1　各组大鼠不同时间点脑组织病理学图（HE染色，×40）

2.2HE染色脑组织病理学改变见图1。电针对照组和假手术组细胞排列整齐，形态正常，结构完整。模型组可见神经元细胞大部分消失，现存的细胞失去完整结构，胞体缩小，核固缩，核碎裂明显，随着缺血时间的延长，神经细胞损伤减轻，细胞结构逐渐恢复，后期出现胶质细胞增生。电针组可见对应时间点神经细胞损伤较模型组轻，胶质细胞增生明显，血管内皮细胞长入。

2.3TTC染色后大鼠脑组织梗死体积比较见表2。电针对照组和假手术组未出现明显的梗死灶，模型组及电针组各个时间点均出现不同程度的梗死灶，电针组不同时间点脑梗死体积均小于模型组，术后7 d差异有统计学意义（P＜0.05），术后21 d差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2　各组大鼠不同时间点脑梗死率（%，±s）

表2　各组大鼠不同时间点脑梗死率（%，±s）

组别n7 d14 d电针对照组1000假手术组1000模型组1039.07±0.88*31.47±2.34*电针组1038.35±1.21*△△21.43±1.06*△△

图2　各组大鼠不同时间点SYN的蛋白表达（×40）

2.4各组大鼠不同时间点SYN的蛋白表达分析与比较见图2，表3。镜下显示SYN在电针对照组和假手术组表达弱。脑缺血后在血肿周围区、皮质区见有棕黄色的阳性表达，主要表现为细胞浆表达，细胞形态多为卵圆形，细胞体积增大，核仁明显，随着缺血时间的延长，细胞表达逐渐增强，有的甚至出现双核；电针组与模型组比较阳性细胞数更多，多呈散在的或聚集分布，着色逐渐加深，表达更明显。从统计学分析阳性细胞数（以积分光密度表示）：2个时间点假手术组和电针对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），模型组表达较假手术组增多，比较差异有统计学意义（P＜0.01），电针组表达比模型组更明显（P＜0.05）。

表3　各组大鼠不同时间点SYN的蛋白表达量（±s）

表3　各组大鼠不同时间点SYN的蛋白表达量（±s）

组别n14 d 7 d电针对照组101.31±0.29假手术组101.29±0.28模型组104.46±0.89*1.26±0.13 1.28±0.12 2.75±0.72*电针组105.13±0.96△3.47±1.04△

3　讨论

相关研究表明急性期脑梗死的运动功能恢复和中枢神经可塑性密切相关，而神经可塑性的研究是目前亟待解决的问题之一［8］。新近研究发现，SYN的表达在促进神经结构与功能重建、神经生长发育等方面起着关键作用［9］。

SYN分子量为38 kda，为糖蛋白，定位于各种神经末梢的突触前囊泡上，可作为突触前膜的特异性标志，它与突触的形成有关，其含量高低可准确反映突触数目的多少，因此SYN等与神经可塑性密切相关，其基因表达与蛋白含量的变化可直接影响到相互联系的神经元数目、突触数量，被认为是神经可塑性的标志蛋白［10-11］。突触素通过其磷酸化作用参与并调节谷氨酸、乙酰胆碱等神经递质的释放和通过突触素结构作用来影响着神经可塑性。脑缺血损伤后，SYN参与Ca2+依赖性神经递质释放，介导突触小泡与突触前膜融合，同时与突触前小泡膜上的多种蛋白质相互作用，如与ATP酶组成复合体，形成突触小泡的“质子泵”，参与突触的外排、内吞循环，使突触再生和构建新的突触连结，并协助细胞骨架蛋白运输神经递质，从而对受损区的功能进行代偿。SYN作为突触前膜的标志，它的定位和定量能够准确反映突触的密度和分布，因此在局灶性脑缺血的梗死区周边表达增高，成为评价突触重建的重要指标［12-13］。Stroemer等［14］观察发现局灶性脑皮质梗死后，随着时间的推移，病灶浅层皮质与对侧相应区域SYN的表达随着时间的推移明显增加，而且神经行为功能的恢复和SYN的表达也呈正相关。曾进胜等［15］研究发现，脑梗死早期，SYN在同侧纹状体、丘脑腹后外侧核和对侧脊髓前角明显增多，大鼠神经功能出现自发性改善。本实验结果显示假手术组和电针对照组各个时间点之间SYN表达无显著差异。提示大鼠大脑未损伤的情况下并不表现明显的突触可塑性；模型组和电针组在对应时间点SYN表达逐渐增强，而且电针组表达增强更明显，说明脑梗死后，不论有无针刺，脑组织均会发生一定程度的可塑性变化，但针刺能更强地促进缺血后突触的功能增强，促进脑的可塑性增强。

本实验大鼠针刺采用天津中医药大学石学敏院士创立的“醒脑开窍”针刺法。该法取穴中百会、水沟穴归属于督脉，位于头部正中依“腧穴所在，主治所在”故可以治疗脑病，达到升提清阳，醒脑调神，开窍启闭的作用；相关实验也发现它们对脑卒中偏瘫患者大脑皮层的中枢生物电有良好的调节作用［16］；内关可调节心的输出量，改善脑循环。三阴交属足太阴脾经，为足三阴经交会之处，统治脾、肝、肾三阴经所主疾病，为治血之要穴。对于该法临床治疗数十万例，通过对9005例脑卒中患者进行总结，总有效率达到98.56%［17］。对于电针，是在毫针基础上在针刺频率、波型波宽、电流强度、刺激时间等给予量化，以便定量分析提高疗效。

本实验中大鼠脑梗死体积的缩小和运动功能的恢复与SYN的表达呈正相关，至于它们之间的具体关系，由于样本量小，观察时间较短，后期尚待进一歩研究证实。

［1］罗祖明，丁新生.缺血性脑血管病学［M］.北京：人民卫生出版社，2011：1001.

［2］Philipp T，Rabih G，Tawk WP，et al.Medical therapy for ischemic stroke：review of intravenous and intra arterial treatment options［J］.World Neurosurg，2011，76（6S）：9S-15S.

［3］Young AR，Ali C，Duretête A，et al.Neuroprotection and stroke：time for compromise［J］.J Neurochem，2007，10（3）：1302-1309.

［4］Liu W，Mukherjee M，Sun C，et al．Electroacupuncture may help motor recovery in chronic stroke survivors：apilot study［J］.J Rehabil Res Dev，2008，45（4）：587-595.

［5］张琳瑛.中风的针灸治疗概况［J］.针灸临床杂志，2004，20（6）：61-63.

［6］Zea Longa E，Weistein PR，Calson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［7］华兴邦，周浩良，李辞荣，等.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991，2（1）：1-5.

［8］谭峰.脑缺血-复流性脑损伤神经可塑性变化领域的研究［J］.中国临床康复，2004，8（1）：144-145.

［9］Leelerc N，Beesloy PW，Brown L，et al.Synaptopbysin expression during synaptopbysin in the rat cerebral cortex［J］.J Comp Neurol，1989，280：197-212.

［10］Liu HX，Zhang JJ，Zheng P，et al.Altered expression of MMP-2，GAP-43 and synapatophysin in the hippocampus of rats with chronic cerebral hypoperfusion correlates with cognitive impairment［J］.Mol Brain Res，2005，13（9）：169-177.

［11］Komitova M，Johansson BB，Eriksson PS.On neural plasticity new neurons and the postischemic milieu：an integrated view on experimental rehabilitation［J］.Exp Neurol，2006，19（9）：42-55.

［12］马岱朝，陈卫银，李红刚.参芎滴丸对大鼠脑缺血再灌注后神经可塑性的影响［J］.中成药，2012，34（5）：814-818.

［13］于炳新，吕传真，罗玉敏.rhG-CSF增加实验性脑缺血周围区的突触囊泡蛋的表达［J］.中国临床神经科学，2006，14（6）：590-593.

［14］Stroemer RP，Kent TA，Hulsebosch CE.Neocorticol neural sprouting，synaptogenesis，and behavaioral recovery after neocortical infarction in rats［J］.Stroke，1995，2（6）：2135-2136.

［15］曾进胜，李华，范玉华，等.实验性大鼠皮层梗死后中枢神经系统相关部位的神经可塑性［J］.中国脑血管病杂志，2002，17（2）：69-71.

［16］左方，石现，田嘉禾，等.电针头穴对人脑运动功能区糖代谢影响的正电子发射段层扫描研究［J］.中国康复理论与实践，2008，14（3）：237-238.

［17］石学敏.“醒脑开窍”针刺法治疗中风病9005例临床研究［J］.中医药导报，2005，11（1）：3-5.

Effect of Experimental Study of Xingnaokaiqiao Acupuncture Therapy on the Recovery of Motor Function and the Expression of SYN on Cerebral Ischemia Reperfusion Rat Model at Early Stage

LI Qinpan，WANG Wei，HAN Yongsheng，et al.Affiliated Hospital of Institute Neurology，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Anhui，Hefei 230061，China

Objective：To restore the effect of the Xingnaokaiqiao acupuncture therapy on the recovery of motor function and the expression of SYN after focal cerebral ischemia reperfusion in rats at the early stage.Methods：Healthy adult male SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，electro acupuncture group and the electroacupuncture group，with 40 rats in each group.They were established to middle cerebral ischemia reperfusion model by suture method.Electroacupuncture were performed in the electro acupuncture group and the electroacupuncture group at acupoints of two Neiguan（PC06），shuigou（DU26），Sanyinjiao（SP06），Baihui（DU20），for 30 minutes.The first acupuncture in animal model after the success of 24 h，followed by acupuncture once a day every morning，every 7 days for a course of treatment（acupuncture for 6 days to rest 1 days）.The sham operation group，model group were conventionally fed on the cage，without any intervention therapy.20 Rats of each group were assessed with longa，s score，and taked 10 rats to Compare the volume of cerebral infarction and detect the expression of SYN with the method of immunohistochemical SP in 7 d and 14 d.Results：Electro acupuncture control group and sham operation group rats without neurological deficit，the nerve functional recovery in rats with electro acupuncture group was better than that of the model group in 7 d and 14 d.Electroacupuncture control group and sham operation group had no infarction after being stained with the method of TTC，the volume of cerebral infarction about the electroacupuncture group was obviously less than that in model group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.A small amount expression of SYN with immunohistochemical SP method for detection of electro acupuncture control group and sham operation group，the increasedexpression of SYN around cerebral ischemia the rats in the model group at the two time points，compared with the sham operation group was significant（P＜0.01）.Expression of SYN about electroacupuncture group compared to the model group increased significantly（P＜0.05）at two time points.Conclusion：The Xingnaokaiqiao acupuncture therapy can promote the recovery of neurological function after focal cerebral infarction in the rats.The mechanism may be related to promoting the expression of SYN and improving neural plasticity after the focal cerebral ischemia reperfusion in rats

Xingnaokaiqiao acupuncture method；Cerebral ischemia reperfusion；Motor function；SYN；Neural plasticity

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0019-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.007

2014-09-23）

安徽省自然科学基金项目（1308085MH140）

（电子邮箱：hyssp@126.com）