酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用

王 倩， 白函瑜， 毛学英

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用

王 倩， 白函瑜， 毛学英*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

为探讨酪蛋白糖巨肽（GMP）酶解物的二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制作用，选择木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分别酶解GMP获得糖巨肽酶解物，选择甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺为底物的发色底物法检测DPP-4活性。结果表明，GMP酶解物的DPP-4抑制效果优于GMP本身，并且随酶解时间的延长酶解物DPP-4抑制作用逐渐增加，其中GMP木瓜蛋白酶解物对DPP-4抑制效果最好，GMP木瓜蛋白酶酶解物作为DPP-4抑制剂具有潜在应用价值。

糖巨肽；酶解；DPP-4抑制剂

编者按：长期航天飞行对航天员身体的影响涉及多个方面，如肠胃功能减弱、心血管系统紊乱，甚至糖代谢失常等。研究表明，失重环境下人体对钾、锌的需求增加，而对钠、铁的需求降低，胰岛素水平呈下降趋势。饮食调节是保障航天员身体健康的有效途径，本期的两篇文章《酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用》和《电感耦合等离子体发射光谱法测定黑茶元素溶出特性》分别从食源性功能多肽和日常茶饮的角度为科学合理配置航天食谱提供了有益参考。

（主持人：陈斌研究员）

糖尿病是一种受遗传和环境因素影响的多因素内分泌疾病，主要表现为高血糖、糖尿和负氮平衡等代谢紊乱症状，还会引起足部坏疽、尿毒症、脑血管病变、心肌梗死等并发症，是危害人类健康的一种严重代谢性疾病［1-2］。糖尿病主要包括1型糖尿病、2型糖尿病两种类型，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占全部糖尿病患者的90%以上［3-4］。目前对糖尿病的治疗主要以西药为主，但长期服用副作用大。

天然来源的二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制剂具有安全性良好、无不良反应、耐受性好等优点［5］，DPP-4抑制剂逐渐成为干预2型糖尿病的新靶点。它通过竞争性的结合DPP-4的活性位点改变DPP-4构象，降低DPP-4的催化活性，抑制DPP-4对肠促胰岛素的降解，增加血液中肠促胰岛素浓度，使肠促胰岛素更好地发挥刺激胰岛素释放的作用，增强胰岛细胞对血糖的敏感性，强化组织细胞对葡萄糖摄取利用，促进β细胞增生等作用［6］。

乳蛋白是乳中的主要营养成分，作为一种全价蛋白质不仅能够提供优质氨基酸，经过适当可控酶解后还能释放出生物活性肽，这些活性肽具有调节胃肠道运动、调节免疫、降血压、抗菌、清除自由基和促进矿物元素吸收等多种生物学功能［7-8］。乳蛋白肽还具有DPP-4抑制作用，有研究已经从β-乳球蛋白酶解物中分离出了具有抑制DPP-4活性的肽Ile-Pro-Ala，Val-Ala-Gly-Thr-Trp-Tyr［9-10］。酪蛋白和乳清分离蛋白分别经碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶酶解所得酶解物均具有DPP-4抑制作用［11-13］，但目前尚未见酪蛋白糖巨肽（GMP）及其酶解物DPP-4抑制作用的相关报道。

酪蛋白糖巨肽（glycomacropeptide，GMP）是κ-酪蛋白在胃蛋白酶作用下苯丙氨酸-蛋氨酸之间的肽键断裂形成的含有64个氨基酸的糖基磷酸肽［14］。研究发现，GMP具有降低人体总胆固醇、甘油三酯、血糖、胰岛素水平的能力［15］。在太空失重环境中，机体糖代谢会发生变化，如胰岛细胞胰岛素分泌量下降以及细胞糖消耗减少等［16-17］。基于乳源活性肽丰富的生物学活性功能以及GMP血糖调节能力，本研究旨在探讨GMP及其酶解物对DPP-4酶的抑制作用，为GMP的进一步开发利用提供基础，也为GMP在太空失重环境中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木瓜蛋白酶、DPP-4、Gly-Pro-PNA、Ile-Pro-Ile（又称为Diprotin A）、TNBS，Sigma公司；碱性蛋白酶，丹麦诺维信公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，美国Amresco公司；酪蛋白糖巨肽，丹麦Arla公司；Tris粉末、NaOH（分析纯）、HCl（分析纯），北京化工厂。

1.2 仪器与设备

iMarkTMMicroplate Reader型酶标仪，美国Bio-RAD公司；L20型冷冻干燥机，北京松源华兴有限公司；DK-8B型电热恒温水浴锅，上海精宏试验设备有限公司；FE20型分析天平，北京塞多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GMP酶解物的制备［18］

利用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶分别酶解GMP，酶解条件如表1。按底物质量浓度50 g/L称取酪蛋白糖巨肽于室温下充分溶解2 h，并将恒温水浴锅温度调至各酶的最适温度，加碱或酸调节达到酶最适pH值，再按酶与底物质量分数为5%的比例把酶加入在恒温水浴锅中酶解。酶解过程中不断加入1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl来维持酶最适pH值，分别于酶解0.25，0.50，0.75，1，2，3，4，5 h处取样，最后在85℃灭酶15 min，冻干待用。

表1 4种蛋白酶酶解条件Tab.1 Hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.2 DPP-4活性测定［19］

检测DPP-4活性采用发色底物法，底物选择甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）。各物质添加量如表2。按照样品或Diprotin A、DPP-4、Tris-HCl缓冲液、Gly-Pro-PNA的顺序依次加入96孔板，在37℃、pH值为8.0条件下反应30 min后于405 nm处用酶标仪测定吸光值。

DPP-4抑制率=［1-（OD实验组-OD空白组）/（OD阴性对照组-OD空白组）］×100%。

表2 DPP-4活性测定体系各组分加入量Tab.2 Adding amount of reactants for DPP-4 inhibition assayμL

1.4 水解度测定

水解度（DH）测定采用三硝基苯磺酸（TNBS）法，样品用1%十二烷基硫酸钠稀释后取0.125 mL先后与1 mL磷酸缓冲液、1 mL 0.1%TNBS溶液混匀在50℃条件下水浴避光反应60 min，用2 mL 0.1 mol/L HCl终止反应后室温冷却并于420 nm下测吸光值，见式（1）。式（1）中：h表示酶解物中每克被裂解的肽键的物质的量，（meq/g protein）；htot表示每克原料蛋白质的总肽键的物质的量。

1.5 统计学方法

数据结果以均值±SD形式表示，采用SPSS13.0软件中One-way ANOVA进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 GMP动物性蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度

GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物对DPP-4的抑制作用及其水解度变化如图1。整体来看，随着酶解时间的延长，GMP酶解物DPP-4抑制率和水解度均逐渐增加，水解度在第5小时达到最大值，GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物水解度最大值分别为4.09%±0.22%，4.71%±0.29%。GMP经蛋白酶酶解0.25 h所得酶解物DPP-4抑制率与GMP无显著性差异（P＞0.05）；GMP经胰蛋白酶酶解5 h时，胰蛋白酶酶解物DPP-4抑制率达到最大值21.86% ±0.19%；GMP经胃蛋白酶酶解3 h所得产物的DPP-4抑制率最高，为32.50%±0.38%（样品终质量浓度为1.0 g/L）。

图1 GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物DPP-4抑制率及其水解度Fig.1 DPP-4 inhibition rate and DH of GMP hydrolysates obtained by pepsin and trypsin

2.2 GMP其他来源蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度

GMP木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度如图2。在蛋白酶作用下，GMP酶解物的DH随酶解时间的增加逐渐增大，酶解时间为5 h时DH达到最大，木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶酶解物DH最大值分别为11.33%±0.18%，9.31% ±0.37%。GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4抑制作用显著优于GMP本身（P＜0.05），酶解4 h所得酶解物的DPP-4抑制率最高为69.30%±1.58%，但与第1小时酶解物无显著差异（P＞0.05）；GMP碱性蛋白酶DPP-4抑制率酶解时间的延长整体呈上升趋势，第4小时酶解物的DPP-4抑制率最高为29.10%±0.97%，酶解时间为5 h时，酶解物的DPP-4抑制率下降，低于第4小时酶解物的DPP-4抑制率。

图2 GMP木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶酶解物DPP-4抑制率及其水解度Fig.2 DPP-4 inhibition rate and DH of GMP hydrolysates obtained by papain andalkaline

2.3 GMP木瓜蛋白酶酶解物对DPP-4抑制作用

的剂量效应

由2.2结果可知，GMP经木瓜蛋白酶酶解第1小时酶解物的DPP-4抑制效果最好，对该酶解物进行DPP-4抑制效果的剂量效应评价，结果如图3。DPP-4抑制率随酶解物浓度增加呈剂量依赖性增加，最大值为85.69%±0.17%，高于阳性对照Diprotin A（0.01 g/L）的DPP-4抑制率。GMP木瓜蛋白酶第1小时酶解物IC50为497.0 mg/L，Diprotin AIC50为19.71 mg/L。

图3 不同浓度GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4抑制率Fig.3 DPP-4 inhibition rate of different concentrations of GMP hydrolysate obtained with papain

3 结 论

DPP-4抑制剂由于具有特殊的氨基酸组成、序列或者特殊的结构从而可以与DPP-4酶活性位点结合［20-21］，进而可以抑制DPP-4对内源性GIP和GLP-1的降解，延长和提高肠促胰岛素的活性，促进胰岛素分泌、降低血糖。多肽类物质的N端第二位上有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）时，该多肽就会成为DPP-4发挥活性的主要底物，如乳源活性肽Val-Ala、Ile-Pro-Ala-Val-Phe、Ile-Pro-Ala-Val-Phe-Lys均具有DPP-4抑制作用［19，22］。

本研究发现，GMP酶解物的DPP-4抑制作用优于GMP本身，主要由于蛋白酶的作用使含有64个氨基酸的GMP肽键断裂产生了具有DPP-4抑制作用的肽段。其中，GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4的抑制作用较好，这与木瓜蛋白酶特殊的作用位点有关。木瓜蛋白酶（3.4.22.2）可裂解碱性氨基酸（Arg、Lys、His），Leu或Gly的肽键，经木瓜蛋白酶酶解后能产生N端第二位上有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽。

GMP经木瓜蛋白酶酶解1 h获得的酶解产物对DPP-4抑制效果较好，作为一种乳源活性肽，其食用安全性高，作为DPP-4抑制剂用于糖尿病干预具有潜在应用价值。GMP酶解产物活性肽段的分离纯化和氨基酸序列鉴定，及其抑制DPP-4活性的作用机制尚待进一步研究。

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Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitory Activity of Casein Glycomacropeptide Hydrolysates

WANG Qian， BAI Hanyu， MAO Xueying*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The aim of the present study was to investigate the dipeptidyl peptidase-4（DPP-4）inhibitory activity of glycomacropeptide（GMP）hydrolysates obtained with papain，alkaline，trypsin and protease. The DPP-4 activity was assayed by the chromogenic substrate with Gly-Pro-PNA as a substrate in vivo. GMP hydrolysates showed a higher DPP-4 inhibitory rate than native GMP.The DPP-4 inhibitory activity of GMP hydrolysates increased during the hydrolysisperiods.GMP hydrolysates obtained by papain possessed the greatest DPP-4 inhibitory activity.The papain-treated GMP may have the potential application as DPP-4 inhibitor.

glycomacropeptide；hydrolysis；dipeptidyl peptidase-4 inhibitor

叶红波）

TS252.1；Q816

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.004

2095-6002（2015）02-0019-05

王倩，白函瑜，毛学英.酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用［J］.食品科学技术学报，2015，33（2）：19-23.

WANG Qian，BAI Hanyu，MAO Xueying.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitory activity of casein glycomacropeptide hydrolysates［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：19-23.

2015-02-17

国家自然科学基金资助项目（31371753）；国家级大学生科研创新项目（201410019040）。

王 倩，女，硕士研究生，研究方向为乳源活性肽；

*毛学英，女，教授，博士，主要从事功能乳品方面的研究。

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