蜂花粉3种溶剂提取物的抗氧化性研究

吕佳宁， 李 影， 韩立杰， 刘子菱， 张 玲， 金铁岩，2，*

（1.延边大学理学院，吉林延吉 133002；2.延边大学农学院，吉林延吉 133002）

蜂花粉3种溶剂提取物的抗氧化性研究

吕佳宁1， 李 影1， 韩立杰1， 刘子菱1， 张 玲1， 金铁岩1，2，*

（1.延边大学理学院，吉林延吉 133002；2.延边大学农学院，吉林延吉 133002）

为了综合评价蜂花粉不同溶剂提取物的抗氧化效果，以水、甲醇和三氯甲烷为提取溶剂，对蜂花粉进行多次综合提取，计算其得率后，对DPPH清除率、·O-阴离子清除率、·OH-自由基清除率和还原力进行测定。结果表明：3种溶剂提取物中，蜂花粉水提物的得率最高，为54.16%。蜂花粉甲醇提取物的DPPH清除率、·O-清除率和·OH-自由基清除率均优于其他两种溶剂且存在浓度依赖关系，当甲醇提取物的质量浓度为5 g/L时，其DPPH清除率达到95.49%，且当甲醇提取物的质量浓度为2 g/L时，·O-阴离子和·OH-自由基清除率分别为80.03%，29.14%。蜂花粉三氯甲烷提取物还原力最强，并且还原力与浓度存在依赖关系，三氯甲烷提取物质量浓度为5 g/L时，还原力达到49.48%。实验表明，蜂花粉的甲醇提取物抗氧化能力较强。

蜂花粉；溶剂提取物；抗氧化能力

花粉是植物的精细胞，在雄蕊的花药中产生。蜂花粉是蜜蜂从开花的蜜源植物内采集的花粉，加上蜜蜂自身的腺体分泌的物质以及唾液混合后，形成的不规则扁圆形团状物［1］。花粉的花粉壁由内壁和外壁组成，外壁比较坚硬，主要成分为孢粉素，抗水、抗腐蚀性很强，并且不易发生渗透作用，基本上与大部分物质不发生反应；内壁主要成分为纤维素和果胶等物质，质地比较薄软，不耐酸碱。由于蜂花粉结构比较特殊，如果不对其进行破壁提取的话，里面的物质只能通过内壁的萌发孔和萌发沟［2］缓慢释放出来，不易于内容物的提取，造成花粉内功能性成分以及营养物质的浪费。

蜂花粉几乎含有人体所需的所有营养物质，营养成分丰富且完全。相关研究显示，它的蛋白质含量是牛肉和鸡蛋的5～7倍，含有8种人体必需氨基酸，且游离氨基酸比例适当［3］，易于人体消化吸收。蜂花粉还含有不饱和脂肪酸、酶类、核酸、多酚、黄酮、多糖等生理活性成分。蜂花粉对癌症、心脏病、高血压、高血脂、高血糖等多种疾病有很好的预防和改善作用，并且对增强抵抗力、记忆力，改善脑功能也有很好的作用［4］。

蜂花粉为全营养食品，其成分较为复杂，且需破壁后才能进行内容物提取。在以往的蜂花粉抗氧化测定中，多数用70%左右乙醇溶液对破壁后的蜂花粉进行提取，很少有研究用纯有机溶剂直接提取蜂花粉。本实验用水、甲醇、三氯甲烷分别对蜂花粉进行充分提取，挥干溶剂得到提取物，然后测定提取物的抗氧化能力，并以Vc为阳性对照，确定哪一种溶剂更为适合提取蜂花粉。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂花粉，长白山脉野生蜂花粉；乙醇、三氯甲烷、维生素C、DPPH、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等均为分析纯。

1.2 主要仪器

SB-10A型高速粉碎机，上海市蒲恒信息科技有限公司；U-3900型紫外分光度计，Hitachi High-Technologies Corporation Tokyo Japan；THA-B型气浴恒温振荡器，金坛市恒丰仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 原料处理

选择长白山山脉的野生蜂花粉，收集后将其高速粉碎，将粉碎后的蜂花粉粉末过60目筛，之后将剩余粉末继续粉碎，重复上一步操作，直至所有粉末全部通过60目筛网，于低温下保存。

1.3.2 蜂花粉的破壁

采用复合破壁法对蜂花粉粉末进行破壁。首先将蜂花粉粉末的水分质量分数提高至30%～35%，控制温度为35℃，持续48 h，然后在45℃下进行鼓风干燥，将干燥后结成团块的蜂花粉再次进行高速粉碎，这样做的目的是将坚硬的蜂花粉外壁变得容易被溶剂浸透，易于内容物的释放，然后将二次粉碎好的蜂花粉冷藏保存。

1.3.3 蜂花粉的提取及得率的测定

取5 g破壁后的蜂花粉于离心管中，按1∶8的比例添加提取溶剂，37℃下摇床提取1 h，350 W超声提取30 min，5 000 r/min离心10 min［5］，重复3次（超声时间依次减半），将3次提取液过滤后合并，旋转蒸发浓缩，将浓缩液置于恒温真空干燥箱内［6］，45℃下挥干其中溶剂，直至恒重后得浸膏状固体。所得固体质量与原蜂花粉质量比，即为得率。

1.3.4 维生素C标准溶液及提取物待测液的配制

分析天平准确称取1.0 mg抗坏血酸粉末，用无水乙醇溶解后，定容至50 mL容量瓶，得0.02 g/L维生素C溶液，4℃避光保存。分析天平准确称取一定质量的提取物定容至25 mL容量瓶中，得适当浓度的提取物溶液。水提取物以水为溶剂，甲醇提取物以甲醇为溶剂，三氯甲烷提取物以无水乙醇为溶剂，因为三氯甲烷不稳定，在室温下极易挥发、分解，如以三氯甲烷为溶剂，后续实验误差极大，无法进行。

1.3.5 DPPH清除能力的测定

根据参考文献［7-8］等的方法，分别测定蜂花粉3种溶剂提取物的DPPH清除率。

1.3.6 ·O-清除能力的测定

根据苏晓雨等［9］的方法，采用邻苯三酚法测定蜂花粉3种溶剂提取物的·O-清除率。

1.3.7 ·OH-清除能力的测定

根据陈晨等［10］的方法，采用水杨酸法对样品的·OH-清除能力进行测定。

1.3.8 还原力的测定

根据文献［11-12］等的方法稍作修改，测定样品的还原力。不加样液组吸光度为A空白，加样液组吸光度值为A样品。

2 结果与分析

2.1 蜂花粉3种溶剂提取物得率

综合多次提取结果，得出：蜂花粉水提取物的得率为54.16%，甲醇提取物的得率为46.06%，三氯甲烷提取物的得率为4.85%，由此可见，单从提取角度考虑，水为蜂花粉提取的较佳溶剂。

2.2 蜂花粉3种溶剂提取物DPPH清除能力

目前，对抗氧化能力的评价方法有很多，但DPPH法是一种便捷度强，灵敏度高且价格相对便宜的测定方法。DPPH是有机自由基，且很稳定，通过加入抗氧化物质，将其由紫色还原成黄色，用吸光度的变化来衡量样品抗氧化能力的强弱。图1为水、甲醇、三氯甲烷3种溶剂在相同提取条件及相同浓度下测定的提取物的DPPH清除能力。3种溶剂的DPPH清除能力均随着溶剂的质量浓度的增大而增大，但甲醇和水提取物在质量浓度高于4 mg/mL时，清除率增加有减缓的趋势；甲醇提取物的DPPH清除能力明显高于水和三氯甲烷提取物，而水和三氯甲烷提取物之间的DPPH清除能力相近。以Vc做阳性对照，当Vc质量浓度为0.03 g/L时，DPPH清除率达到94.13%；甲醇提取物质量浓度为5 g/L时，DPPH清除率为95.49%，所以在此浓度下两者的DPPH清除能力相近，但甲醇蜂花粉提取物的DPPH清除能力远远低于Vc。

2.3 蜂花粉3种溶剂提取物·O-清除能力

图2为3种样品·O-清除能力分析结果，由图2可知，3种样品均有·O-清除能力，且清除能力均随着质量浓度的增大而增加。当甲醇提取物的质量浓度为0.4～0.8 g/L时，其·O-清除能力与其他两种溶剂差异不显著；当甲醇提取物的质量浓度大于0.8 g/L时，其·O-清除能力增加趋势明显高于水提取物和三氯甲烷提取物，且三氯甲烷提取物与水提取物在各质量浓度间的·O-清除能力均不存在显著性差异。以Vc为阳性对照，当Vc添加量为0.02 g/L时，·O-清除率为94.53%，甲醇提取样添加量为2 g/L时，·O-清率为80.03%，所以Vc的·O-清除能力远高于此3种溶剂的提取物。

图1 3种溶剂提取物的DPPH清除率Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging activity of three solvent extracts

图2 3种溶剂提取物的·O-清除率Fig.2 Comparison of·O-radical scavenging activity of three solvent extracts

2.4 蜂花粉3种溶剂提取物·OH-清除能力

·OH-自由基是一种很活泼的自由基，当其与·O-发生反应后可以破坏人体的DNA，对人体造成不可逆的伤害。·OH-较容易发生电子转移、夺取氢原子，发生羟基化反应，使体内的糖类、蛋白质、脂类、核酸等物质发生氧化反应，遭到破坏［13］。图3为蜂花粉3种溶剂提取物·OH-清除能力分析结果。由图3可知，3种溶剂的提取物均具有·OH-清除能力，且3种溶剂提取物的清除能力差异显著；甲醇提取物的·OH-清除能力在提取物质量浓度为2 g/L内基本上呈线性增长；水提取物的质量浓度为0.8～1.2 g/L时增长不明显，但当其质量浓度大于1.2 g/L时，增长较快；三氯甲烷提取物在质量浓度为1.6 g/L时，·OH-清除能力达到峰值，随后下降。以Vc为阳性对照，当Vc添加量为0.02 g/L时，其清除率为38.23%。Vc的添加浓度远小于此3种溶剂提取物的添加量，所以Vc的·OH-自由基清除能力远高于此3种溶剂提取物。

图3 3种溶剂提取物的·OH-清除率Fig.3 Comparison of·OH-radical scavenging activity of three solvent extracts

2.5 蜂花粉3种溶剂提取物还原力

还原力是指某种物质能提供电子，与活泼自由基反应后能转化为较为稳定的物质，不再让自由基的链式反应继续进行下去，从而阻止自由基对人体的伤害。图4为3种样品在同样提取条件及同样浓度下测定的还原能力，由图4可知，3种样品均具有还原能力，且还原能力均随着样品浓度的增大而增加；三氯甲烷样品的还原力增加趋势明显高于水和甲醇样品。以Vc为阳性对照，当Vc的质量浓度为0.02 g/L时，还原力为63.40%；三氯甲烷质量浓度为5 g/L时，还原力为49.48%，由此可见，Vc的还原力明显高于3种溶剂的提取物。

图4 3种溶剂提取物的还原力Fig.4 Comparison of reducing power capacity of three solvent extracts

3 结 论

本实验分别研究了蜂花粉的水提取物、甲醇提取物和三氯甲烷提取物的得率和抗氧化性，结果表明，水、甲醇、三氯甲烷3种溶剂的提取率中，水提取物的得率最高，达到54.16%；1～5 g/L甲醇提取物的DPPH清除能力均高于其他两种溶剂提取物，当甲醇提取物的质量浓度达到5 g/L时，其DPPH清除率达到95.49%；0.4～2 g/L甲醇提取物的·O-清除能力高于其他两种溶剂提取物，在甲醇提取物的质量浓度为2 g/L时，其清除率达到80.03%；与三氯甲烷·OH-清除率先上升后下降的趋势相比，甲醇提取物·OH-清除率基本呈线性增长，当甲醇提取物的质量浓度为2 g/L时，清除率达到29.14%；1～5 g/L三氯甲烷提取物的还原能力均高于水和甲醇提取物，当三氯甲烷提取物的浓度为5 g/L时，其还原力为49.48%，所以三氯甲烷提取物的还原力强于其他两种溶剂提取物，因此蜂花粉甲醇提取物的抗氧化能力在此3种溶剂中最强。

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Study on Antioxidant Activities of bee Pollen Extractives Using Three Kinds Solvents

LÜ Jianing1， LI Ying1， HAN Lijie1， LIU Ziling1， ZHANG Ling1， JIN Tieyan1，2，*
（1.College of Science，Yanbian University，Yanji 133002，China；2.College of Agriculture，Yanbian University，Yanji 133002，China）

To investigate the antioxidant activities of the bee pollen extractives，water，methanol，and chloroform were used as extraction solvents and DPPH eliminating rate，·O-removing rate，·OH-eliminating rate，and reducing power were determined.The results showed that the water extraction had the highest yield（54.16%）while the extractives from methanol had the highest DPPH eliminating rate，·O-removing rate，and·OH-eliminating rate and the antioxidant activities increased with the increasing concentration.The highest DPPH eliminating rate（95.49%）was obtained under the concentration of 5 g/L while the highest·O-removing rate（80.03%）and·OH-eliminating rate（29.14%）were obtained under the concentration of 2 g/L.The chloroform extracts had the highest reducing power（49.48%）under the concentration of 5 g/L.Based on the results，methanol extractives had the best antioxidant activities.

bee pollen；solvent extraction；antioxidant activities

叶红波）

TS201.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.010

2095-6002（2015）02-0054-04

吕佳宁，李影，韩立杰，等.蜂花粉3种溶剂提取物的抗氧化性研究［J］.食品科学技术学报，2015，33（2）：54-57.

LV Jianing，LI Ying，HAN Lijie，et al.Study on antioxidant activities of bee pollen extractives using three kinds solvents［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：54-57.

2014-03-12

吕佳宁，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品；

*金铁岩，男，副教授，博士，主要从事功能性食品方面的研究。

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