海洋扩展青霉（Penicillium expansum）产耐盐型果胶酶的固态发酵优化

吴　　爽，张　　敏，潘仁瑞，蔡敬民，

（1.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥230036；2.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥230601）

海洋扩展青霉（Penicillium expansum）产耐盐型果胶酶的固态发酵优化

吴爽1，张敏2，潘仁瑞2，蔡敬民1，2

（1.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥230036；2.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥230601）

目的：提高海洋扩展青霉（Penicillium expansum）产耐盐型果胶酶的酶活力。方法：测定海洋扩展青霉所产果胶酶的耐盐性；通过单因素和正交实验，对海洋扩展青霉产耐盐型果胶酶进行固态发酵优化；利用SPSS 20.0分析实验结果。结果：该果胶酶在底物所含NaCl浓度为30g/L时，酶活力最高，在NaCl浓度为0～60g/L范围内较稳定。最优培养基为：麸皮7g，果胶粉0.42g，氯化铵0.28g，人工海水8.4mL；最优培养条件为：接种量3mL（107cfu/mL），培养温度28℃，250mL三角瓶中培养72h。此优化条件下酶活力可达到6639.79U/g。结论：该果胶酶耐盐性好；固态发酵优化后，酶活力达到6639.79U/g，为原来的酶活1239.80U/g的5.36倍。

扩展青霉，果胶酶，耐盐性，固态发酵，条件优化

果胶酶（pectinase）是指能够分解果胶质的一类酶的总称，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、果胶裂解酶等［1-2］。果胶酶广泛应用于果汁澄清、木材防腐、麻类脱胶、棉织物精练、天然药物活性成分提取、饲料加工、茶叶发酵、环保等领域［3-7］。国外在20世纪30年代开始研究果胶酶，在菌种选育、发酵条件优化、酶纯化等领域已经取得了很多成果，中国从20世纪60年代开始研究果胶酶，目前工业化生产落后于法国、德国、荷兰、丹麦、意大利等果胶酶的主要生产国［2］，然而中国地域广袤，海域辽阔，微生物资源非常丰富，因此利用微生物生产果胶酶并优化其发酵条件，提高果胶酶产量，获得稳定性好，活力高的果胶酶，成为推动我国果胶酶工业化生产的重要途径。

我国很多学者是从腐烂的果蔬或者果园泥土中筛选出产果胶酶的菌株［1，7-8］，对于海洋来源的产果胶酶菌株的研究报道甚少，由于海洋环境的复杂性，海洋微生物能产生具有特殊性质的活性物质，例如极端酶（包括耐热酶、耐冷酶、耐酸酶、耐碱酶和耐盐酶等），耐盐酶在较高盐离子浓度和有机溶剂存在的生物工艺过程中具有较大的应用潜力，因此提高耐盐酶的产量对工业生产有重要意义。本文从实验室保藏的一株海洋扩展青霉（Penicillium expansum）出发，研究其所产果胶酶的耐盐性，果胶酶的耐盐性鲜有报道，这一性质有利于提高果胶酶纯化工艺中酶活性的保留率及果胶酶在高盐环境中的应用，但该菌株产果胶酶能力较低，因此本文对其产耐盐型果胶酶的发酵工艺进行优化；由于固态发酵相比液态发酵，具有成本低，设备简单，产物浓度高等特点，工业多采用固态发酵方式，因此本文选择固态发酵方式，以期为深入研究海洋来源的产果胶酶菌株和工业应用提供理论指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、果胶粉、麦芽糖、蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵、碳酸氢铵、NaCl、MgCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、柠檬酸钠、柠檬酸、KCl、K2HPO4、Na2CO3、H3BO3、MnCl2·4H2O、Na2MnO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

电子天平湘仪天平仪器设备有限公司；752型紫外-可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅国华电器有限公司；ZHTH-112C垂直超净工作台北京东联哈尔滨一汽制造有限公司；XPX-9082MBE数显不锈钢电热培养箱上海智诚分析仪器制造有限公司；YSQ-LS5DSⅡ立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司；离心机北京雷勃尔离心机有限公司灭菌锅。

1.2实验方法

1.2.1菌株扩展青霉（Penicillium expansum），分离自浙江苍南海域的海水，保藏于本实验室。

1.2.2培养基的配制具体如下：

种子培养基：PDA培养基。

基础发酵培养基：分别称取麸皮7g，葡萄糖0.5g，NaNO30.5g，加到250mL三角瓶中，再加入人工海水7mL，搅匀，自然pH，121℃高压灭菌20min。

人工海水的配制（w/v）：NaCl 2.95%，MgCl2·6H2O 0.2%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.35%，CaCl2·2H2O 0.05%，海水微量元素Ⅰ0.5%（v/v），海水微量元素Ⅱ0.01%（v/v）。海水微量元素Ⅰ的配制（w/v）：K2HPO40.3%，EDTA 0.015%，柠檬酸钠0.1%，柠檬酸0.06%，Na2CO31.04%；海水微量元素Ⅱ的配制（w/v）：H3BO30.216%，MnCl2·4H2O 0.181%，Na2MnO4·2H2O 0.039%，Co（NO3）2·6H2O 0.0049%［9］。

1.2.3果胶酶耐盐性实验果胶酶分别降解含不同浓度NaCl（0、15、30、45、60、75、90、105、120g/L）的果胶底物，测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。

1.2.4单因素实验设计

1.2.4.1固态发酵培养基的确定从基础发酵培养基出发，依次用不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、果胶粉、麦芽糖），不同氮源（蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵、碳酸氢铵），人工海水与蒸馏水，不同料水比（1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2、1∶2.5、1∶3g/mL）取代基础培养基中对应的条件，其他条件以基础培养基中为准。

1.2.4.2固态发酵培养条件的确定在上述培养基优化的基础上，考察在培养温度为28℃时，不同接种量（1、2、3、4、5mL）对扩展青霉产果胶酶的影响；并考察在接种量为3mL时，不同培养温度（20、24、28、32、36、40、44℃）对扩展青霉产果胶酶的影响。

1.2.5正交实验设计根据单因素实验结果，选择碳源、氮源、料水比、接种量进行L9（34）正交实验，如表1所示。

表1　正交实验因素水平Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.2.6孢子悬液的制备活化的PDA斜面，加10mL的无菌生理盐水，洗下孢子至装有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀，用血球计数板计数，调整孢子浓度大约107cfu/mL。

1.2.7固态发酵与粗酶液的制备按照各步骤配方配制培养基并接种，28℃条件下培养3d取出，每瓶固态发酵酶曲中倒入50mL pH5.4的缓冲液，室温浸提1h，浸提液用六层纱布过滤，再经7000r/min离心10min去除沉淀，上清液即为粗酶液。

1.3酶活力方法

采用DNS法，参考文献［10］作适当修改。

取0.2mL适当稀释的酶液于试管中，50℃水浴平衡5min，加入1.8mL水浴平衡过的0.4%的果胶底物溶液，50℃水浴反应30min后，加3mL DNS试剂终止反应，沸水浴10min，冷却后蒸馏水定容到20mL，摇匀；以灭活的酶液做空白对照。在540nm波长处测定吸光度。在上述反应体系中，以每毫升酶液1min降解果胶底物产生1μg半乳糖醛酸定义为1个酶活力单位（U）。

1.4数据处理方法

用SPSS 20.0统计软件建立数据库并处理数据。结果组间差异用One way ANOVA检验，两组间差异采用LSD法进行多重比较，利用Origin Pro V8.6软件绘制图表。

2　结果与分析

2.1海洋扩展青霉所产果胶酶的耐盐性

果胶酶分别降解含不同浓度NaCl的果胶底物，结果如图1所示，NaCl浓度为30g/L时，果胶酶活力最高，定为100%，在NaCl浓度达到60g/L时，果胶酶活力仍能保持80%以上，说明海洋扩展青霉所产果胶酶有较好的耐盐性［11］，在NaCl浓度为0～60g/L范围内较稳定。这可能与本株扩展青霉生长在海水环境中有关。

图1　盐度对果胶酶活力的影响Fig.1　Effect of salinity on the activity of pectinase

该耐盐的果胶酶可应用于高盐环境［12］中果胶质的降解，关于果胶酶耐盐性方面的研究鲜有报道，但该果胶酶活力不高，仅为1239.80U/g干曲，因此进一步优化其固态发酵工艺，提高果胶酶活力。

2.2海洋扩展青霉固态发酵培养基的单因素实验

2.2.1碳源种类对扩展青霉产果胶酶活力的影响碳源对微生物生长代谢有着至关重要的作用，它为微生物生长、发育提供能量和各种化合物的碳骨架。选择五种不同碳源替代基础发酵培养基中的葡萄糖，研究碳源种类对扩展青霉产果胶酶的影响。

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、果胶粉、麦芽糖都能为扩展青霉生产果胶酶提供碳源，如图2所示，以果胶粉作为碳源，酶活最高，可能是因为果胶酶是诱导酶［13］，果胶粉既作为碳源，又起到诱导剂作用，诱导扩展青霉产生果胶酶，分解果胶粉，为自身生长提供能量；其次为蔗糖、麦芽糖。后期对果胶粉添加量（0、1%、2%、4%、6%、8%）进行研究，得到6%添加量即4.2g最佳，因此选择果胶粉、蔗糖、麦芽糖添加4.2g进行正交试验。

2.2.2氮源种类对扩展青霉产果胶酶活力的影响氮源参与微生物机体的蛋白质、核酸等的合成，也会影响到微生物果胶酶的合成，因此，以不同氮源替代基础发酵培养基中的硝酸钠。

如图3所示，上述所有氮源都能维持扩展青霉生长，并产生果胶酶，以0.5g氯化铵/7g麸皮作为氮源时，酶活最高，达到3264.37U/g，其次为硝酸铵、蛋白胨。氯化铵、硝酸铵这两种无机氮源对酶活的影响普遍优于有机氮源，这也与Jing等［14］、柯崇榕等［15］的研究结果类似。同时，有机氮源蛋白胨也使酶活达到了比较高的水平，为2498.39U/g，可能是蛋白胨是一种混合物，里面所含的某些小分子氮源起到了作用。后期对氯化铵添加量（0、1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%）进行研究，得到4%添加量，即0.28g最佳，故选择氯化铵、硝酸铵、蛋白胨添加量为0.28g进行正交试验。

学生在学习数学的过程中，总有一些共性的“难点”“瓶颈”难以突破，比如学习“三角形面积”时，需要学生能将三角形转化为已经学过的图形，用已学过的面积计算方法来解决三角形的面积问题。如果没有教师的引导与介入，学生很难自觉想到用两个同样的三角形拼成一个平行四边形（倍拼）的方法。倍拼的方法并非在学习三角形时才出现，学生之所以迁移的能力不足，与他们缺少“倍拼”的基本活动经验有很大关系。是否有可能设计一节数学实验课，让学生自然而然地发现“倍拼”是帮助解决图形问题的重要方法，从而帮助学生积累这种经验，促进学生有关图形知识的内化与迁移。

2.2.3人工海水和蒸馏水对扩展青霉产果胶酶活力的影响以蒸馏水替代培养基中的人工海水，结果如图4所示。

图3　氮源种类对扩展青霉产果胶酶活力的影响Fig.3　Effect of nitrogen sources on the activity of pectinase from Penicillium expansum

图4　人工海水和蒸馏水对扩展青霉产果胶酶活力的影响Fig.4　Effect of artificial seawater and distilled water on the activity of pectinase from Penicillium expansum

随着培养时间的延长，果胶酶活力均呈先显著上升（p＜0.05），后显著下降（p＜0.05）的趋势，在加蒸馏水时，扩展青霉也能产生果胶酶，但果胶酶活力显著（p＜0.05）低于人工海水条件，说明该株海洋扩展青霉需要在加入海水的条件下才能较好的生产果胶酶，这很可能与海水中含有的金属元素有关。

2.2.4料水比对扩展青霉产果胶酶活力的影响如图5所示，料水比为1∶1.2时，酶活最大，为3906.62U/g，低于或高于1∶1.2，酶活力均降低，可能因为水量不足时，影响扩展青霉生长；水量充足后，由于是静置培养，随着水分增加，透气性下降，影响菌体生长，抑制果胶酶产生，因此确定料水比为1∶1.2。

2.3海洋扩展青霉固态发酵培养条件的单因素实验

2.3.1接种量对扩展青霉产果胶酶活力的影响如图6所示，当接种量为3mL（107cfu/mL）时，果胶酶酶活力最高，为4252.73U/g，接种量大于3mL，酶活力逐渐下降，原因是菌体过多，自身生长已将培养基中的营养物质消耗殆尽，没有剩余的营养供给菌体产果胶酶，所以酶活力降低。

2.3.2培养温度对扩展青霉产果胶酶活力的影响如图7所示，培养温度低于28℃时，随着温度上升，果胶酶活力逐渐升高，培养温度为28℃时，果胶酶活力最高，温度超过28℃，果胶酶活力迅速降低。因为温度较低时，菌体生长繁殖缓慢，产酶量少，果胶酶活力低，温度过高，又不利于菌体生长，甚至造成菌体死亡，使得果胶酶活力迅速降低。

图5　料水比对果胶酶活力的影响Fig.5　Effect of ratio of material to water on the activity of pectinase

图6　接种量对果胶酶活力的影响Fig.6　Effect of amount of inoculum on the activity of pectinase

图7　温度对果胶酶活力的影响Fig.7　Effect of temperature on the activity of pectinase

2.4正交实验

表2　正交实验结果Table 2　Results of orthogonal test

由极差分析结果可知，对该株海洋扩展青霉产果胶酶活力影响大小依次为：氮源＞碳源＞接种量＞料水比，最佳产酶工艺条件为A3B2C2D2，即接种量3mL，果胶粉0.42g，氯化铵0.28g，料水比1∶1.2（人工海水8.4mL），正交实验表中无此组合，因此再次发酵验证，得到酶活为6639.79U/g干曲，为优化前1239.80U/g干曲的5.36倍。

3　结论与讨论

利用一株海洋扩展青霉进行固态发酵生产耐盐型果胶酶，得到最佳培养基为：麸皮7g，果胶粉0.42g，氯化铵0.28g，人工海水8.4mL。最佳培养条件为：250mL三角瓶中装入上述最佳培养基，接种3mL（107cfu/mL），28℃培养72h，酶活达到6639.79U/g，提高到了5.36倍；本文获得的果胶酶具有较好的耐盐性，该果胶酶在底物所含NaCl浓度为30g/L时，酶活力最高，在NaCl浓度为0～60g/L范围内较稳定。

对比他人研究，吕丽娟等［7］优化扩展青霉YL-9固体发酵产果胶酶，最终酶活力为752.29U/g，本文的最终酶活力相对高许多，吕丽娟利用苹果渣作为碳源，与之相比，本文的果胶粉可以作为碳源，同时对果胶酶的产生有诱导作用；Gupta Shefali等［16］对枯草芽孢杆菌RCK产果胶酶的固态发酵条件优化后，使酶活提高了3.4倍，本文通过优化，使酶活达到初始的5.36倍；本文所用的扩展青霉，与黑曲霉相比，产果胶酶活力较低［17-18］，可能是菌种不同，从而在表达果胶酶基因上的差异造成的。本文研究的果胶酶的优势是该果胶酶有耐盐性，有较好的应用价值，且经发酵优化，酶活已达到比较高的水平，要进一步提高酶活，可以通过诱变育种，基因工程等技术［2］。

我国海域辽阔，海洋微生物资源非常丰富，且容易获得，以海洋微生物出发，寻求稳定性好，活力高的果胶酶，应用于工业生产，有利于提高我国果胶酶制剂的品质。本文得到的果胶酶耐盐性好，有实际应用价值。本文为探究海洋真菌产耐盐型果胶酶提供了理论指导，拓宽了果胶酶的来源，为进一步深入研究海洋来源的真菌所产果胶酶的性质，分子结构等方面提供了基础。后期将对果胶酶进行纯化，测定其氨基酸序列，克隆果胶酶编码基因并在酵母中表达，以进一步提高果胶酶产量。

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Optimization of solid fermentation conditions of marine Penicillium expansum for producing salt tolerant pectinase

WU Shuang1，ZHANG Min2，PAN Ren-rui2，CAI Jing-min1，2
（1.College of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.School of Biological and Environmental Engineering，Hefei University，Hefei 230601，China）

Objective：To improve the capacity of marine Penicillium expansum for producing salt tolerant pectinase. Methods：Salt tolerance of pectinase from marine Penicillium expansum was investigated.Solid fermentation conditions of pectinase from marine Penicillium expansum were optimized by single factor and orthogonal experiments.Statistical data was analyzed by SPSS 20.0.Results：Pectinase activity was the highest at the concentration of 30g/L NaCl，and was stable in 0～60g/L NaCl.The optimal condition for Penicillium expansum was composed of bran 7g，jelly powders 0.42g，ammonium chloride 0.28g and artificial seawater 8.4mL，and was cultured at 28℃for 72h with 3mL（107cfu/mL）inoculation in each 250mL triangle flask.The pectinase activity could reach 6643.49U/g.Conclusion：The pectinase had good salt tolerance.Pectinase activity could reach 6643.49U/g under optimized conditions，which was 5.36 times more than that at the initial conditions with 1239.80U/g.

Penicillium expansum；pectinase；salt tolerance；solid fermentation；conditions optimization

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.040

2014－10－28

吴爽（1988-），女，在读硕士研究生，主要从事微生物酶学和海洋微生物活性天然产物方面的研究。

蔡敬民（1963-），男，博士，教授，主要从事微生物酶学和海洋微生物活性天然产物方面的研究。

安徽省教育厅自然科学项目（KJ2012B153）。