植物乳杆菌L-45发酵南极磷虾壳的影响因素研究

姜启兴，陈雪姣，许兆滨，许艳顺，刘富俊，于沛沛，夏文水，*

（1．江南大学食品学院，江苏无锡214122；2．辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁大连116113）

植物乳杆菌L-45发酵南极磷虾壳的影响因素研究

姜启兴1，陈雪姣1，许兆滨2，许艳顺1，刘富俊2，于沛沛1，夏文水1，*

（1．江南大学食品学院，江苏无锡214122；2．辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁大连116113）

本文对植物乳杆菌L-45发酵南极磷虾壳进行了研究。研究了外加碳源、发酵时间、发酵温度等因素对发酵过程中植物乳杆菌L-45产乳酸的变化及虾壳脱钙率的影响。确定了较好的发酵条件为：发酵周期48h，发酵温度37℃，葡萄糖添加量为10%，料液比为1∶1，接种量为6%，此条件下脱钙率为84.6%，得到的甲壳素与传统化学法相比，性质相近，且对环境污染小。

植物乳杆菌，南极磷虾壳，pH，脱钙率

南极磷虾分布在南大洋辐合区以南的水域，属甲壳动物纲磷虾目，其成体虽小，但生物量庞大，科学家最新的估计是6.5～10亿吨，是人类可以利用的最大蛋白资源，具有较高的开发价值［1］。南极水域的磷虾种类很多，常见的是南极大磷虾（Euphausia superb），南极磷虾的开发利用始于上世纪60年代［2］，是人类重要的后备蛋白库［3］，除富含蛋白外，还富含亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸及钙、钾、镁、锶等多种矿物质元素，且类胡萝卜素色素含量高［4-5］。目前，国内外研究更多的是南极磷虾肉中蛋白、脂溶性成分等的分离和应用［6］，对磷虾壳资源的研究较少。

虾壳大多作为废弃物丢弃，亟需有效的开发利用，例如利用虾壳废弃物制备甲壳素，但是目前的技术存在明显不足：如一般采用强酸脱钙和强碱脱蛋白，不仅对甲壳素的分子链有一定的破坏，且能耗高，对环境污染较严重，而且其中的蛋白、钙质等矿物质均无法回收［7］。国外已有利用微生物发酵，对虾蟹等废弃物进行生物发酵制备甲壳素的研究，Zakaria［8］使用副干酪乳杆菌发酵虾壳，蛋白质去除率为77.5%。Jung［9］使用了副干酪乳杆菌发酵蟹壳，最终脱蛋白率达到52%。该方法比传统的酸碱法反应更温和、甲壳素结构更稳定，成本低，是一种节能环保的清洁生产方法，发酵残渣即为粗甲壳素，可以实现对资源全面有效的利用，并且易于实现工业化生产［10］。

从上述可见关于干酪乳杆菌发酵虾蟹壳国内外已有研究报道，本研究以实验室筛选出的高产乳酸的植物乳杆菌L-45发酵南极磷虾壳，利用发酵产生的乳酸脱除虾壳中的碳酸钙，研究发酵过程中磷虾壳的pH及脱钙率的变化情况，优化发酵脱钙条件。

1　材料与方法

1.1材料与设备

南极磷虾（Euphausia superb） 辽宁省大连海洋渔业集团公司提供，于-18℃冻藏，冷冻南极磷虾自然解冻，经采肉机采肉三次后得南极磷虾壳，于-18℃冻藏备用；植物乳杆菌L-45（Lactobacillus plantarum）

为食品学院食品加工与配料中心实验室保藏菌种，活化后备用。

JB 5374-91电子天平、FE20实验室pH计梅特勒-托利多（上海）有限公司；YCR-180采肉机上海华夏渔业机械仪器工贸公司；501型超级恒温器上海市实验仪器厂；90-2恒温磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂；UV1000紫外-可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司；4K-15高速冷冻离心机Sigma公司；THZ-D恒温振荡器太仓市豪诚实验仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1外加碳源对植物乳杆菌发酵虾壳发酵产酸和虾壳脱钙率的影响称取经枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白后的虾壳残渣25g，分别添加等量碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、淀粉、麦芽糊精），添加量均为10%；接种5%植物乳杆菌菌液，于37℃发酵12、24、36、48、60、72h，测发酵液pH；每个样品平行3次，确定最合适的碳源。

1.2.2发酵时间对植物乳杆菌发酵虾壳发酵产酸和虾壳脱钙率的影响称取经枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白后的虾壳残渣25g，接种5%植物乳杆菌菌液，料液比为1∶2，10%的葡萄糖，于37℃发酵12、24、36、48、60、72h后分别测发酵液pH，灰分变化；每个样品平行3次，确定最合适的发酵时间。

1.2.3葡萄糖添加量对植物乳杆菌发酵虾壳发酵产酸和虾壳脱钙率的影响称取经枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白后的虾壳残渣25g，接种5%植物乳杆菌菌液，料液比为1∶2，葡萄糖添加量分别为5%、10%、15%、20%、25%，于37℃发酵48h测发酵液pH，灰分变化；每个样品平行3次，确定最合适的葡萄糖添加量。

1.2.4发酵温度对植物乳杆菌发酵虾壳发酵产酸和虾壳脱钙率的影响称取经枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白后的虾壳残渣25g，接种5%植物乳杆菌菌液，料液比为1∶2，葡萄糖添加量为10%，分别于30、35、37、40、45℃发酵48h测发酵液pH，灰分变化；每个样品平行3次，确定最合适的发酵温度。

1.2.5接种量对植物乳杆菌发酵虾壳发酵产酸和虾壳脱钙率的影响称取已经脱蛋白的下脚料残渣25g，料液比为1∶2，葡萄糖添加量为10%，接种量分别为1%、2%、4%、6%、8%、10%，于37℃发酵48h测发酵液pH，灰分变化；每个样品平行3次，确定最合适的接种量。

1.2.6料液比对植物乳杆菌发酵虾壳发酵产酸和虾壳脱钙率的影响称取经枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白后的虾壳残渣25g，葡萄糖添加量为10%，接种量分别为5%，料液比分别为1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，于37℃发酵48h测发酵液pH，灰分变化；每个样品平行3次，确定最合适的料液比。

1.2.7传统酸碱法与生物发酵法制备的甲壳素基本成分比较分析生物发酵法：称取经枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白后的虾壳残渣25g，植物乳杆菌接种量6%，料液比为1∶1，葡萄糖添加量10%，于37℃发酵48h后，过滤酶解液得甲壳素滤渣，蒸馏水冲洗至中性，烘干后测定基本成分。传统酸碱法：称取50g南极磷虾壳，用500mL 5%盐酸浸泡24h，每4h搅拌一次，纱布过滤后水洗至中性，用6%氢氧化钠溶液煮沸1h，纱布过滤，滤渣水洗至中性后烘干测定其基本成分。

1.3分析方法

1.3.1脱钙率的测定脱钙率的测定参照Aytekin［11］，按照以下公式计算：

1.3.2甲壳素得率的测定甲壳素得率［12］（%）=甲壳素的质量/加工下脚料的质量×100

1.4数据处理

数据分析采用SPSS软件；数据绘图采用Origin 8.0软件。

2　结果与分析

2.1不同实验因素对发酵产酸及脱钙率的影响

2.1.1碳源的选择对植物乳杆菌产酸的影响由图1可以看出，以葡萄糖作为碳源时，发酵液的pH最低。此外，可以发现以淀粉为碳源的发酵液pH最高，且难以抑制腐败菌生长，从而使发酵液发生腐败。虽然蔗糖和果糖作为碳源时，植物乳杆菌的产酸效果也很好，但其成本较高，综合考虑，最终选择葡萄糖作为碳源。

图1　碳源的选择对发酵产酸的影响Fig.1　pH trends during fermentation with different carbon source

2.1.2发酵时间对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响由图2可见，在12～72h内，发酵液的pH迅速降低，pH达到3.5左右，此后变化趋缓；此外，虾壳发酵脱钙率在12～48h内呈急剧增高趋势，之后增长速度趋于平缓，产生此结果的原因可能是植物乳杆菌在48h前碳源、氮源等充足，微生物代谢旺盛，但超过48h后，随着营养物质的减少以及产物的反馈抑制，从而产酸变缓，pH下降不显著。较高的酸度有利于虾壳中钙的脱除和抑制腐败现象的发生，而超过48h后发酵液的pH下降已不显著，因此，发酵时间选择48h左右比较合适。

图2　发酵时间对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响Fig.2　pH trends and DM rate during fermentation with different fermentation time

2.1.3葡萄糖添加量对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响在乳酸菌脱钙的研究中，添加葡萄糖更有助于乳酸的产生［13-15］，由图3可以看出，随着葡萄糖添加量的增加，pH呈现下降趋势，且当添加量大于15%时，发酵液中pH无明显变化，虾壳的脱钙率也无明显变化。而对于脱钙率而言当葡萄糖添加量达到10%～15%，基本达到最大值，考虑葡萄糖添加量增大产生的生产成本增加，而且发酵液对于菌体的渗透压也随之增加，这时菌体的生长可能会受到抑制，对发酵造成伤害［10］，因此葡萄糖糖添加量确定为10%。发酵过程中添加的葡萄糖一部分被当作碳源，还有一部分被转化成乳酸，乳酸与虾壳中的碳酸钙反应，钙被溶解形成乳酸钙，因此，在发酵的开始阶段，植物乳杆菌不断消耗葡萄糖，乳酸不易积累，直到发酵时间的增加才产生更多的乳酸，因此，发酵过程中葡萄糖的消耗较大［16］。

图3　葡萄糖添加量对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响Fig.3　pH trends and DM rate during fermentation with different glucose concentration

2.1.4发酵温度对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响植物乳杆菌的最佳生长温度为30～38℃［17］，由图4可以看出，在30～37℃温度范围内发酵液的产酸量较高，pH较低，且37℃时达到最大，pH达到最低，脱钙率较高。因此，选用37℃为最优发酵温度。

图4　发酵温度对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响Fig.4　pH trends and DM rate during fermentation with different temperature

2.1.5接种量对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响图5可以看出，随接种量提高pH降低，但当接种量超过6%以后，pH反而有轻微上升，产生这种现象可能是当接种量增大到一定量时，因为菌种的快速生长导致营养很快耗尽，发酵后期代谢产物的产生受到影响，不能累积足够的酸，因此pH反而上升；同时，接种量为6%时，虾壳脱钙率也达到最大值。考虑实际操作的成本，所以除首次发酵时接种6%用培养基活化的菌种之外，接下来的发酵过程可以用上一次发酵的发酵液进行接种，这种生产上不仅可行而且更节约的方法值得推崇。

图5　接种量对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响Fig.5　pH trends and DM rate during fermentation with different inoculum quanity

图6　料液比对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响Fig.6　pH trends and DM rate during fermentation with different solid-liquid ratio

2.1.6料液比对植物乳杆菌产酸及虾壳脱钙率的影响由图6可以看出，当料液比小于1∶1时，虾壳的脱钙率呈上升趋势，在液料比为1∶1时，虾壳的脱钙率达到最大值，而当料液比达到1∶2以后时，虾壳的脱钙率明显的急剧下降，发酵液pH随料液比的增加而降低；在料液比1∶2时下降趋势趋于平缓，且过大的料液比对副产物（乳酸钙）浓缩等后续工艺操作不利。综合考虑，最佳料液比为1∶1。

2.2生物发酵法与传统酸碱法制备的甲壳素基本成分比较分析

在上述单因素研究初步确定的较好的发酵条件即：发酵周期48h，发酵温度37℃，葡萄糖添加量为10%，料液比为1∶1，接种量为6%下发酵，进行发酵制备甲壳素，并与传统化学法制备的甲壳素进行比较，结果见表1，由表1可以看出，在此条件下脱钙率达到84.6%，略低于传统酸碱法。传统酸碱法与生物发酵法制备的成品甲壳素含量、水分等指标均相近，且甲壳素中的灰分已经很少，只有0.3g/100g左右，根据食品级甲壳素的要求［18］，简单的处理后即可成为商品甲壳素，不需要再经酸碱处理，基本无废水、废渣产生，并且以传统的酸碱法制备甲壳素，强酸和强碱对甲壳素的分子结构有一定的破坏［19］，而且能耗高，下脚料污染环境。

表1　传统酸碱法与生物发酵法制备的甲壳素基本成分及性质Table 1　Compositions and properties of krill waste，residues after chemical treatments and fermentation

3　结论

比较了葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖及可溶性淀粉等碳源对植物乳杆菌发酵南极磷虾壳的影响，表明以葡萄糖为碳源发酵效果好，体系pH最低。研究发现随着发酵时间的延长体系pH逐渐降低，脱钙率逐渐增高，到48h后趋于平缓，初步确定较好的发酵时间为48h。随着葡萄糖添加量的增大体系pH逐渐降低，而钙脱除率则先增大，后降低趋势，在10%～15%达到最大，综合考虑成本问题，选择添加量10%。随着发酵温度、接种量、料液比的增大，体系pH呈先下降后增大趋势，而钙脱除率则呈先增大后降低趋势，最适发酵温度为37℃左右，最适接种量为6%，最适料液比为1∶1。通过单因素实验确定的发酵条件：发酵周期48h，发酵温度37℃，葡萄糖添加量10%，料液比1∶1，接种量6%下发酵制备甲壳素，脱钙率达到84.6%，与传统酸碱化学法制得的甲壳素相比各指标相近，表明利用本方法生产甲壳素具有一定的开发应用前景。

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Study on the influencing factors of fermentation of Antarctic krill shells with Lactobacillus plantarum L-45

JIANG Qi-xing1，CHEN Xue-jiao1，XU Zhao-bin2，XU Yan-shun1，LIU Fu-jun2，YU Pei-pei1，XIA Wen-shui1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group，Dalian 116113，China）

In this study Lactobacillus plantarum L-45 was used as start strains to ferment Antarctic krill shells. The effects of carbon source，the fermentation time，the fermentation temperature and other factors on acid production of L-45 the variation and demineralization rate of krill shell were studied.The optimum fermentation conditions were as follows：fermentation time 48h，temperature 37℃，inoculums quantity 6%，glucose added 10%，and the ratio of material to liquid 1∶1.Under these conditions the demineralization rate was 84.6%.The obtained chitin was similar in nature and friendly to environment compared with the traditional chemical method. Key words：Lactobacillus plantarum L-45；krill shell waste；pH；decalcification rate

TS254.9

A

1002-0306（2015）14-0212-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.035

2014－09－26

姜启兴（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工与保藏。

夏文水（1958-），男，教授，研究方向：食品加工与保藏。

“十二五”国家“863”计划项目（2011AA090801）。