茶黄素和咖啡碱浓度对茶乳酪形成的影响

李　　双，罗理勇，2，刘姝娟，马梦君，曾　　亮，2，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆400715；2.西南大学茶叶研究所，重庆400715；3.湖南省茶叶研究所，湖南长沙410013）

茶黄素和咖啡碱浓度对茶乳酪形成的影响

李双1，罗理勇1，2，刘姝娟3，马梦君1，曾亮1，2，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆400715；2.西南大学茶叶研究所，重庆400715；3.湖南省茶叶研究所，湖南长沙410013）

以茶黄素和咖啡碱的相互作用来模拟茶乳酪的形成体系，通过分析其透光率、沉淀量、茶黄素和咖啡碱质量浓度的变化，研究茶黄素和咖啡碱对茶乳酪形成的影响。结果表明：随茶黄素和咖啡碱质量浓度的增加，其聚合后原溶液和贮藏液的透光率降低，贮藏液的沉淀量增加；并且当固定茶黄素和咖啡碱二者中任一物质的质量浓度，随另外一个物质质量浓度的增加，上述变化趋势显著。灭菌不影响整体的变化趋势，除此之外通过高效液相色谱分析咖啡碱和茶黄素各单体质量浓度的变化发现，咖啡碱和茶黄素-3，3’-没食子酸酯是影响模拟体系中茶乳酪形成的关键因子。基于减少茶乳酪生成，提高红茶饮料的感官效果，并同时尽可能多地保留茶黄素质量浓度，应当选择茶黄素质量浓度低于100mg/L、咖啡碱质量浓度低于200mg/L的红茶原料来制作红茶饮料。

茶黄素，咖啡碱，透光率，茶乳酪

红茶属六大茶类之一，其滋味醇和甘甜，香气馥郁芬芳，且具有助胃肠消化、促进食欲等保健功效［1-3］。随着红茶的迅猛发展，2012年，中国红茶内销量增至9.66万吨，随之红茶饮料的消费量也是急剧增加［4-5］。但红茶茶汤一经冷却就易出现“冷后浑”而生成茶乳酪，其中茶黄素、茶红素、咖啡碱和蛋白质是构成茶乳酪的主要成分［6-7］。茶乳酪对茶汤的口感和色泽造成不良影响，尤其是给速溶冰茶的生产带来一些困难［8-9］。

Robert［10-11］率先开展红茶冷后浑方面的研究，结果认为茶黄素、茶红素及咖啡碱是红茶茶乳酪的主要化学成分，并于1963年测定其比例为17∶66∶17。除此之外，红茶茶汤沉淀物中尚有果胶物质和未被氧化的多酚类、双黄烷醇、矿物质等。阎守和［12］研究表明，红茶茶乳酪中，咖啡碱浓度和沉淀物含量呈明显正相关。Jobstle E等［13］利用NMR和X-射线研究了红茶茶乳酪的形成机理。梁月荣等［14］研究了不同温度、pH条件下茶乳酪的形成情况。吴芳等［15］利用微乳的特殊结构包埋茶饮料中的沉淀物质从而对茶沉淀起到调控作用。当前的研究已明确了红茶茶乳酪的主要组成成分，但是对组成茶乳酪的各成分之间的两两体系（茶黄素-咖啡碱、茶黄素-蛋白质、咖啡碱-蛋白质）的不同浓度对茶乳酪形成的影响程度不明确，大量的研究工作集中在多组分的混合体系上。本文以茶黄素-咖啡碱为模型，研究不同质量浓度的茶黄素和咖啡碱对茶乳酪形成的影响，为从根源上降低茶乳酪的形成，选择制备红茶饮料的合适原材料提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

茶黄素（茶黄素总量=54.017%，其中TF=8.248%，TF-3G=11.438%，TF-3′G=5.062%，TFDG=29.269%）

本实验室自制；咖啡碱上海晶纯生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸（色谱纯）重庆滴水实验仪器有限公司；超纯水美国Millipore公司。

LC-20型高效液相色谱日本岛津公司；PWC124型分析天平上海京工实业有限公司；UV-2450型紫外可见分光光度计日本岛津公司；TOMY ES-315型高压灭菌锅上海艾高德生物科技有限公司；5810型台式高速离心机德国Eppendorf公司；ALPHA1-4LSC型真空冷冻干燥机德国Christ公司。

1.2实验方法

1.2.1茶黄素和咖啡碱混合液的制备按要求称重后分别用超纯水溶液配制4g/L的茶黄素溶液和100g/L的咖啡碱溶液。根据这两个母液，分别取相应的体积，配制茶黄素质量浓度（50、100、200、400mg/L）和咖啡碱质量浓度（200、400、600、800mg/L）交互组成的16个茶黄素-咖啡碱混合液。采用121℃灭菌10min，冷却，加盖。放置室温（25℃）贮藏观察，30d后取出进行分析，测定原液、灭菌液、贮藏液的透光率、沉淀量、咖啡碱和四个主要茶黄素单体质量浓度的变化。

1.2.2物理性状测定透光率测定：在640nm下，用紫外可见分光光度计测定透光率（T640，%）［12］，超纯水做空白。

沉淀量测定：将茶黄素-咖啡碱混合液贮藏液摇匀，准确量取50mL于离心管中，室温下，采用高速离心机离心，弃掉上清液，沉淀冷冻干燥称其质量。

沉淀量（mg/L）=［（离心管与沉淀总质量-离心管质量）×1000］/50

1.2.3咖啡碱和茶黄素单体测定将茶黄素-咖啡碱混合液摇匀，准确量取50mL于离心管中，室温下，采用高速离心机离心，取其上清液作为待测样品，样品用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液采用高效液相色谱检测［16］。

式中：Ci为被测组分的质量浓度（mg/L）；Ai为被测组分的峰面积；A为标准物的峰面积；C为标准物的质量浓度（mg/L）。

1.2.4色谱条件色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流速：0.9mL/min；检测波长：280nm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A：2%冰乙酸，B：乙酸乙酯∶乙腈=7∶1，TF采用梯度洗脱，梯度见表1。

表1　茶黄素各组分检测梯度洗脱表Table 1　Linear gradient elution of concentration of theaflavins components

1.3数据处理

2　结果与分析

2.1混标色谱图分析

在上述色谱条件下进行检测，可得到茶黄素与咖啡碱混合标准品的高效液相色谱图，见图1。根据图1可得知标准品中茶黄素和咖啡碱的出峰时间，进而对样品中的茶黄素和咖啡碱混合液进行定性分析，除此之外，还可以更精准地对样品中咖啡碱和茶黄素各单体组分进行定量分析。

图1　混标色谱图Fig.1　Chromatograms of mixed standard

2.2不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液透光率的变化

测定茶汤在640nm下的透光率来评价茶汤的浑浊度。当反应体系中茶黄素和咖啡碱的质量浓度较小时，茶汤透光率较大，说明聚合后的浑浊度较小；茶黄素和咖啡碱质量浓度的增加对茶汤透光率作用明显，导致茶汤的浑浊度增大，透光率降低，此外，通过相关性分析证明二者质量浓度对溶液的透光率有很大的影响。

不同质量浓度配比的茶黄素-咖啡碱混合体系透光率的变化，见表2。由表2可知，当体系由茶黄素质量浓度50mg/L、咖啡碱质量浓度200mg/L变为茶黄素质量浓度400mg/L、咖啡碱质量浓度800mg/L时，混合液原液的透光率从97.75%降为21.54%，灭菌液的透光率从98.35%降为21.90%，贮藏液的透光率则从96.60%降为3.95%。通过比较发现，灭菌液的透光率变化趋势和结果与原液基本相似，说明灭菌并不影响透光率的变化。贮藏30d后，混合液的透光率明显降低，说明在贮藏期间，茶黄素和咖啡碱之间持续反应，导致透光率降低，茶乳酪增多。固定茶黄素或咖啡碱的质量浓度，随茶黄素或咖啡碱质量浓度的增加，溶液的透光率降低。茶黄素在50mg/L时，增加咖啡碱的质量浓度，混合液原液的透光率从97.75%降为95.25%，仅降低了2.50%；而茶黄素在400mg/L时，增加咖啡碱的质量浓度，混合液原液的透光率从56.72%降为21.54%，降低了35.18%，说明茶黄素对透光率有较大的影响。同样，咖啡碱在200mg/L时，增加茶黄素的质量浓度，混合液原液的透光率从97.75%降为56.72%，降低了41.03%；而咖啡碱在800mg/L时，增加茶黄素的质量浓度，混合液原液的透光率从95.25%降为21.54%，降低了73.71%，说明咖啡碱对透光率也有较大的影响［17］。当茶黄素质量浓度超过100mg/L，咖啡碱质量浓度超过200mg/L，贮藏液透光率的下降率超过23%，茶黄素质量浓度小于100mg/L，咖啡碱质量浓度小于200mg/L，贮藏液的透光率降低幅度较小，所以若要保持饮料澄清，需选择茶黄素质量浓度小于100mg/L，咖啡碱质量浓度小于200mg/L的红茶原料。

表2　不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液透光率变化Table 2　Transmittance changes of different concentration of theaflavins and caffeine solution

通过对茶黄素和咖啡碱混合液原液的实验结果进行Pearson分析，得出透光率与茶黄素浓度相关系数为-0.942**（**表示在0.01水平上显著相关，*表示在0.05水平上显著相关），呈现极显著负相关；与咖啡碱浓度相关系数为-0.915**，呈现极显著负相关，即茶黄素、咖啡碱浓度越高，透光率越小。通过对其进行逐步回归分析，得出其关系式为：

透光率（%）=104.045－0.163×CTF－0.151×C咖啡碱（R2=0.942）

式中，CTF是指模型中茶黄素浓度，C咖啡碱是指模型中咖啡碱浓度。

2.3不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液沉淀量的变化

当茶黄素和咖啡碱质量浓度较小时，其聚合后溶液的沉淀量较少；随着茶黄素和咖啡碱质量浓度的增加，沉淀量也增加。当固定茶黄素或咖啡碱的质量浓度时，溶液的沉淀量随茶黄素或咖啡碱质量浓度的增加而呈增加的趋势（图2）。

图2　不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液沉淀量变化Fig.2　Tea cream amounts change of different concentration of theaflavins and caffeine solution

固定咖啡碱的浓度，当茶黄素质量浓度从50mg/L增加到400mg/L时，沉淀量随其质量浓度的增加而显著（p＜0.05）增加。当茶黄素质量浓度为50mg/L，咖啡碱质量浓度为800mg/L，得到的沉淀量为80mg/L；茶黄素质量浓度为400mg/L、咖啡碱质量浓度为800mg/L，得到最大的沉淀量为480mg/L。说明茶黄素的质量浓度对沉淀量的形成有很大的影响。固定茶黄素浓度为50mg/L时，随着咖啡碱浓度由200mg/L增加到800mg/L，其沉淀量也由22mg/L增加到80mg/L，固定茶黄素浓度为100mg/L时，随着咖啡碱质量浓度的增加，沉淀量呈显著（p＜0.05）增加，当固定茶黄素浓度为200mg/L和400mg/L时，随咖啡碱质量浓度的增加，沉淀量呈显著增加的趋势，说明沉淀量的生成也与咖啡碱的质量浓度大小有关。因此，为抑制茶乳酪的形成，应控制咖啡碱质量浓度低于200mg/L，茶黄素质量浓度低于100mg/L。

通过对实验结果进行Pearson分析，得出沉淀量与茶黄素质量浓度相关系数为0.954**，呈现极显著正相关，即茶黄素质量浓度越高，沉淀量生成的越多；与咖啡碱质量浓度相关系数也为0.954**，同样呈现极显著正相关，即咖啡碱质量浓度越高，沉淀量生成的越多。通过对其进行逐步回归分析，得出其关系式为：

沉淀量（mg/L）=19.652+1.010×CTF+0.48×C咖啡碱（R2=0.954）

2.4不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液茶黄素各组分和咖啡碱质量浓度的变化

Robert［10］指出茶黄素、茶红素和咖啡碱是红茶茶乳酪的主要成分，其中茶黄素和咖啡碱之间的络合作用对茶乳酪的形成起到了很大的作用［18］。本文根据不同质量浓度茶黄素与咖啡碱溶液体系中咖啡碱质量浓度和茶黄素各组分质量浓度的变化规律展开工作，其结果见图3和表3。

由图3可知，当固定咖啡碱的起始浓度，逐渐增加茶黄素质量浓度时，混合液原液中的咖啡碱质量浓度随着茶黄素质量浓度的增加逐渐减小，贮藏液灭菌液的咖啡碱质量浓度与原液变化趋势相同，且在相同茶黄素质量浓度下，灭菌液的咖啡碱质量浓度和原液的咖啡碱质量浓度无明显的差别，说明灭菌不会促进或抑制茶黄素和咖啡碱之间的反应。当贮藏一段时间后发现，咖啡碱的质量浓度与原液相比明显减少，表明在贮藏期间，茶黄素和咖啡碱在持续地反应，并且随着茶黄素质量浓度的增加，贮藏液咖啡碱浓度显著降低。

由表3可知，固定茶黄素的质量浓度，随着咖啡碱质量浓度的增加TF、TF-3G、TF-3′G、TFDG均逐渐减少，且TF-3G、TF-3′G和TFDG均显著下降。通过对灭菌液和原液的比较发现，灭菌液的四个茶黄素单体的质量浓度和原液的四个茶黄素单体的质量浓度大多数无明显差异，与上述二者咖啡碱的比较结果相符，印证了灭菌不会对茶黄素和咖啡碱的络合作用产生影响。随着溶液的贮藏发现，当茶黄素浓度为400mg/L时，有64.62%的TF参与了反应，70.97%的TF-3G参与反应，86.09%的TF-3′G参与反应，达100%的TFDG参与反应。在茶黄素质量浓度为50mg/L时，TF-3′G完全反应，并且茶黄素和咖啡碱的质量浓度比并不影响TFDG与咖啡碱的反应，二者在任意质量浓度时TFDG均完全反应。因此从茶黄素四个主要单体的分析来看，TF、TF-3G、TF-3′G、TFDG均参与沉淀的形成，并且随着溶液的贮藏发现，TFDG与咖啡碱的结合能力比其他三种单体强，TF-3′G与咖啡碱的结合能力又比TF和TF-3G强，主要是因为茶黄素是由成对的儿茶素经氧化缩合而形成的，TFDG所含的没食子酸比其他三种单体带有更多的羟基，与咖啡碱的结合能力最强［19］。综合上述茶黄素和咖啡碱质量浓度对混合液透光率和沉淀量的影响，说明咖啡碱和TFDG是影响模拟体系中茶乳酪形成的关键因子。

图3　不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液中咖啡碱质量浓度的变化Fig.3　Caffeine amounts change of different concentration of theaflavins and caffeine solution

3　结论

探究茶黄素和咖啡碱质量浓度对红茶沉淀的影响是为了从原料选择方面来降低沉淀的形成。基于本研究主要探讨茶黄素和咖啡碱之间的络合对红茶茶乳酪形成的影响，根据红茶中茶黄素类的含量一般为0.3%～1.5%，得出茶汤中的茶黄素质量浓度为60～300mg/L；且综合实验体系中茶黄素-咖啡碱混合液对溶液透光率、沉淀量和咖啡碱、茶黄素单体剩余量的结果来看，在生产纯茶饮料或冰茶时，若要保持饮料比较澄清，并且尽可能多地保留茶黄素质量浓度的情况下，需选择茶黄素质量浓度低于100mg/L、咖啡碱质量浓度低于200mg/L的原料来制作红茶饮料。

表3　不同质量浓度茶黄素-咖啡碱混合液中茶黄素单体组分质量浓度的变化Table 3　Change in concentration of theaflavins components in different concentration of theaflavins and caffeine solution

续表

本研究对探究红茶茶乳酪的形成机理具有一定的参考价值。除本文已研究的茶黄素-咖啡碱模型对茶乳酪形成的影响外，实验室正在构建茶黄素-蛋白质、咖啡碱-蛋白质，以及茶黄素-咖啡碱-蛋白质的模型，体系化研究红茶饮料茶乳酪形成机理，为茶饮料的进一步开发提供参考。

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Effect of different concentrations of theaflavins and caffeine on the formation of tea cream

LI Shuang1，LUO Li-yong1，2，LIU Shu-juan3，MA Meng-jun1，ZENG Liang1，2，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Tea Research Institute，Southwest University，Chongqing 400715，China；3.Tea Research Institute，Hunan Province，Changsha 410013，China）

A model system consisting of theaflavins and caffeine was set up for studying the mechanism for the formation of tea cream in black tea.The transmittance，amount of tea cream，theaflavins and caffeine concentration of the solution were investigated to study the effects of different concentrations of theaflavins and caffeine compounds on the formation of tea cream.The results showed that the transmittance of the original solution and store solution was decreased，and the amount of precipitate was increased with adding the concentration of theaflavins and caffeine.These changing trends were more pronounced with increasing concentration of one of the two components at a constant level of the other.Sterilization didn’t influence these trends.In addition，high performance liquid chromatography analysis of the concentration of caffeine and theaflavins showed that caffeine and TFDG were the main compounds forming tea cream.In order to reduce tea cream，improve the sensory evaluation of black tea beverage，and at the same time retain theaflavins concentration as much as possible，the concentration of theaflavins was less than 100mg/L and caffeine concentration was less than 200mg/L when black tea raw materials were chosen to produce black tea drinks.

theaflavins；caffeine；transmittance；tea cream

TS272

A

1002-0306（2015）14-0092-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.009

2014－11－13

李双（1991-），女，硕士研究生，主要从事茶饮料方面的研究。

曾亮（1980-），女，博士，副教授，主要从事茶资源综合利用方面的研究。

国家自然科学基金青年科学基金项目（31100500）；重庆市科委自然科学基金计划项目（CSTC，2013jcyjA80021）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013B036）。