慢性荨麻疹患者外周血白细胞介素9和转录因子PU.1的表达及意义

张明海 戴前梅 胡春艳 陈晨 陈朋

·论著·

慢性荨麻疹患者外周血白细胞介素9和转录因子PU.1的表达及意义

张明海 戴前梅 胡春艳 陈晨 陈朋

目的 探讨白细胞介素9（IL-9）和Th9细胞与慢性荨麻疹的关系。方法 收集门诊慢性荨麻疹患者30例，另30例健康志愿者作为对照组。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血IgE水平，流式细胞仪检测外周血CD4+IL-9+细胞比例，实时荧光定量PCR检测外周血单一核细胞（PBMC）IL-9、PU.1 mRNA的表达。两组间定量资料比较采用独立样本t检验，相关性检验采用Pearson分析。结果 慢性荨麻疹患者PBMC IL-9及PU.1 mRNA的表达水平均显著高于健康对照组（4.44±1.90比3.20±1.78，3.26±1.59比2.34±1.47，t=2.60，2.34，均 P ＜ 0.05）。慢性荨麻疹患者外周血 CD4+IL-9+细胞比例 ［（0.63 ± 0.44）%］、IgE 水平［（82.04± 31.72）IU/ml］与健康对照组［（0.22± 0.12）%、（60.74± 28.26）IU/ml］比较均明显升高（t=5.04，2.75，均P＜0.01）。慢性荨麻疹患者外周血CD4+IL-9+细胞比例、IL-9及PU.1 mRNA与IgE水平均呈正相关（R=0.596，0.767，0.746，均P＜0.01）。结论 Th9细胞和IL-9可能参与慢性荨麻疹的发病。

荨麻疹；白细胞介素9；Th9细胞

既往认为白细胞介素9（IL-9）主要由Th2细胞产生。最近研究表明，IL-9主要来源于新发现的CD4+T细胞亚群即Th9细胞，并且人Th9细胞只特异性分泌 IL-9［1］。PU.1 即 PU.1 boxes是 Ets家族中最重要的转录因子，因其能结合富含嘌呤的GAGGAA序列而得名，是Th9细胞分化及IL-9介导过敏反应的重要且必需的转录因子［2］。最近研究表明，记忆性Th9细胞主要定居于皮肤，能自分泌或旁分泌促炎症细胞因子，其异常激活会导致过敏性皮肤病的发生［1，3］。国内关于Th9细胞与慢性荨麻疹的发病关系未见报道。本研究通过检测慢性荨麻疹患者的外周血Th9细胞IL-9及其转录因子PU.1的表达水平，探讨Th9细胞是否参与慢性荨麻疹的发病。

对象与方法

一、对象

1．对象：我院皮肤科门诊慢性荨麻疹患者30例，男11例，女19例，年龄15～51岁，平均（30.9±9.1）岁；对照组为健康献血者30例，男13例，女17例，年龄 18～46岁,平均（26.5±9.4）岁。两组间年龄、性别比较差异无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。

2.入选和排除标准：入选标准：①风团每天发作且持续时间超过6周；②年龄＞12岁；③无明显的诱发原因如，食物、药物、运动；④发病无规律。排除标准：①风团持续时间超过24 h；②有明显的诱因如，人工划痕症、胆碱能性荨麻疹、水源性荨麻疹，日光性荨麻疹等；③过去1个月内系统使用过糖皮质激素、免疫抑制剂等；④过去3 d用过抗组胺药；⑤合并其他皮肤病、系统性疾病、感染性疾病等。

二、方法

1.主要试剂和仪器：人IgE ELISA试剂盒产自上海博谷生物科技有限公司；固定和改变细胞膜渗透性试剂盒（FIX＆PERM Cell Permeabilization Kit）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD4单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人IL-9单克隆抗体、相应荧光素标记的同种型对照抗体均产自美国eBioscience公司。佛波酯（Phorbol myfismte acetate，PMA）、离子霉素（ionomycin）、布雷杆菌素 A（Brefeldin A，BFA） 工作液产自瑞士 Enzo Life Sciences公司。TaKaRa逆转录试剂盒产自宝生物（大连）有限公司。WD-9417A型酶标仪产自北京泽兰西科技有限公司；流式细胞仪产自德国Partec公司；荧光定量PCR仪产自日本Bioer公司。

2.标本采集：抽取所有受试者静脉血5 ml。1 ml放入无添加剂采血管，2 ml放入肝素抗凝采血管；2 ml放入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管。

3.Th9细胞比例测定：取肝素抗凝血，Ficoll密度梯度法提取单一核细胞（PBMC），取PBMC悬液与 100 μl 10%胎牛血清（FBS）RPMI1640 ml培养基混匀。在培养体系中加入佛波酯、离子霉素、布雷杆菌素A工作液，使其终浓度分别为50 μg/L、1 mg/L和0.4 μmol/L。在37℃、5%CO2培养箱中刺激培养4 h。取培养PBMC 100 ml，放入已标记的流式细胞仪检测专用管中，分别加入FITC标记的鼠抗人CD4抗体 10 μl，设同型对照，4℃避光孵育 20 min。加入Cytofix/Cytoperm缓冲液100 μl，4℃避光孵育30 min。加入 Cytoperm Plus缓冲液 100 μl，600 ×g离心5 min，弃上清，重复本步骤一遍。向残留物加入PE标记的鼠抗人IL-9单克隆抗体2.5 μl，设同型对照，4℃避光孵育30 min。加入1 ml PBS，600×g离心5 min，弃上清，重复本步骤一遍。用1 ml PBS重悬，流式细胞仪分析，以CD4+细胞设门，计算CD4+IL-9+细胞占CD4+细胞的比例。

4.IL-9 mRNA和PU.1 mRNA检测：取EDTA抗凝血，Ficoll密度梯度法提取PBMC。Trizol法常规提取总RNA。按照TAKARA逆转录试剂盒说明书，将2 μl总RNA逆转录为cDNA。RTFQ PCR反应的引物及探针由生工生物（上海）股份有限公司设计和合成。IL-9引物及探针：上游5′-CCTGGACATCAAC TTCCTCATCA-3′，下游 5′-TCAGAGGGAATGCCCA AACA-3′，探针 5′-FAM-AAGATGCAGGAAGATCBHQ1-3′；PU.1 引物及探针：上游 5′-ACGCCAAAC GCACGAGTATT-3′，下游 5′-GTCCCAGTAATGGTC GCTATGG-3′，探针 5′-FAM-CCCTATCTCAGCAGT GAT-BHQ1-3′；β肌动蛋白引物及探针：上游5′-C CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游 5′-CGCCGATC CACACGGAGTA-3′，探针 5′-FAM-TCAAGATCATT GCTCCTCCTGAGCGCAA-BHQ1-3′。反应体系20μl Realtime mix 10 μl，上游1 μl（5 μmol/L），下游1 μl（5 μmol/L），探针1 μl（2.5 μmol/L），cDNA 2 μl，重蒸水 5 μl。扩增条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s 45个循环，采用2-△△Ct法计算相对表达量，△△Ct=△Ct目的-△Ct管家。

5.血清IgE测定严格按人免疫球蛋白E（IgE）ELISA试剂盒说明书操作，全自动酶标仪450 nm波长依序测量标准品和样本的吸光度（A值），最后根据标准曲线计算样本相应的浓度。

6.统计学方法：采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，计量资料采用独立样本t检验，相关关系采用Pearson相关分析。

结 果

一、CD4+IL-9+细胞比例

慢性荨麻疹患者外周血CD4+IL-9+细胞比例明显高于健康对照组，见图1。两组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

二、Th9细胞相关细胞因子基因表达水平

慢性荨麻疹患者组PBMC IL-9 mRNA、PU.1 mRNA表达水平均高于对照组，两组间比较差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

三、相关性分析

图1 流式细胞仪检测外周血CD4+IL-9+细胞比例 1A：患者；1B：健康对照

表1 两组外周血CD4+IL-9+细胞比例、IL-9 mRNA、PU.1 mRNA表达水平（±s）

表1 两组外周血CD4+IL-9+细胞比例、IL-9 mRNA、PU.1 mRNA表达水平（±s）

组别 例数 CD4+IL-9+细胞（%） IL-9 mRNA PU.1 mRNA IgE（IU/ml）慢性荨麻疹组 30 0.63±0.44 4.44±1.90 3.26±1.59 82.04±31.72健康对照组 30 0.22±0.12 3.20±1.78 2.34±1.47 60.74±28.26 t值 5.04 2.60 2.34 2.75 P值 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01

慢性荨麻疹患者血清IgE水平明显高于对照组，差异有统计学意义（t=2.75，P＜ 0.01），且患者CD4+IL-9+细胞比例、IL-9 mRNA、PU.1 mRNA 与IgE 水平呈正相关，r值分别为 0.596、0.767、0.746，r2分别为 0.355、0.589、0.557，均P＜ 0.01。

讨 论

目前认为I型变态反应是慢性荨麻疹主要发病机制之一。I型变态反应由IgE介导，肥大细胞和嗜碱性粒细胞等效应细胞以释放生物活性介质的方式参与反应。IgE的产生涉及Th2细胞的分化和IgE类别转换。Th9细胞的发现，使人们对Th2的在过敏性疾病中的作用有了新的认识。Th9细胞和Th2细胞的分化都需要信号转导和转录激活因子6（STAT6）和GATA结合蛋白3（GATA-3）的调控，因此Th9与Th2细胞可能存在共同的分化通路，并在一定条件下相互转化［4］。研究表明，PU.1在Th9细胞分化中起着重要的作用，并调控IL-9，参与过敏性炎症的发生和发展［2］。Th9细胞的主要效应细胞因子IL-9能够提高肥大细胞的生存和功能，增加IL-4诱导IgE的产量，IL-9单独或与干细胞因子或与FcεRI结合能够提高培养的肥大细胞炎性因子的表达，并刺激上皮细胞表达或产生趋化细胞因子，从而导致嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞的浸润［1］；IL-9还能增加肠道肥大细胞数量，参与食物过敏的病理过程［5］。因此，我们猜测Th9细胞可能与Th2细胞共同参与I型变态反应，并与荨麻疹发病有关。

目前关于慢性荨麻疹患者外周血免疫细胞相关炎性介质如组胺、IL-6、IL-18、IL-31等的研究报道不一。有研究表明，慢性荨麻疹患者外周血组胺、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-6、IL-18、IL-31等明显高于对照组［6-9］。也有研究显示，慢性荨麻疹患者外周血组胺、TNF、IL-6、IL-18、IL-31、IL-9 等并不升高［10-11］。荨麻疹的发病往往呈间断性、短暂性、此起彼伏，病情不稳定，患者数分钟就有可能症状完全消失。同时有的天然细胞因子半衰期很短，如组胺半衰期一般为30 min，而IL半衰期可能更短，有的只有几分钟［12］。以上原因易造成实验时间差，可能是引起研究差异的部分因素。本研究结果表明，慢性荨麻疹患者组外周血CD4+IL-9+细胞比例、PBMC表达的IL-9及PU.1 mRNA均高于健康，差异有统计学意义（P分别＜0.01，＜0.05，＜0.05），支持Th9细胞参与慢性荨麻疹的发病过程。但慢性荨麻疹病发病过程中存在多种免疫细胞失衡现象［13-14］，因此Th9细胞在慢性荨麻疹发病中充当何种角色，仍需研究。本研究结果表明，慢性荨麻疹患者外周血IgE水平高于健康，差异有统计学意义，与既往研究一致［6，15］。慢性荨麻疹患者外周血CD4+IL-9+细胞比例、PBMCIL-9 mRNA及PU.1 mRNA水平均与血清IgE浓度呈正相关，提示慢性荨麻疹患者外周血IgE水平的高低与Th9细胞异常可能有关。重症过敏患者血清IgE水平可增加1 000倍，特异性IgE一旦产生，即与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面FcεRI结合，调节肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面FcεRI表达，只有与肥大细胞表面FcεRIα结合的IgE与相应特异性抗原结合才能激发Ⅰ型变态反应，而血清IgE还没有与肥大细胞FcεRIα结合，因此慢性荨麻疹患者血清IgE升高机制以及其在慢性荨麻疹发病中的作用仍需深入研究。

总之，本研究结果表明，Th9细胞及IL-9可能在慢性荨麻疹发病过程中起作用。因此，IL-9有可能成为慢性荨麻疹免疫学治疗另一个新的靶点。由于慢性荨麻疹患者存在多种免疫细胞异常，因此需要深入研究Th9细胞与其他CD4+T细胞亚群如Th1、Th2、Th17、Treg细胞在慢性荨麻疹发病过程中的相互关系。

［1］He SH,Liu ZQ,Chen X,et al.IL-9+IL-10+T cells link immediate allergic response to late phase reaction ［J］.Clin Exp Immunol,2011,165（1）:29-37.

［2］Chang HC,Sehra S,Goswami R,et al.The transcription factor PU.1 is required for the development of IL-9-producing T cells and allergic inflammation［J］.Nat Immunol,2010,11（6）:527-534.

［3］Schlapbach C,Gehad A,Yang C,et al.Human TH9 cells are skintropic and have autocrine and paracrine proinflammatory capacity［J］.Sci Transl Med,2014,6（219）:219ra8.

［4］Veldhoen M,Uyttenhove C,van Snick J,et al.Transforming growth factor-beta ′reprograms′the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset［J］.Nat Immunol,2008,9（12）:1341-1346.

［5］Forbes EE,Groschwitz K,Abonia JP,et al.IL-9 and mast cellmediated intestinal permeability predisposes to oral antigen hypersensitivity［J］.J Exp Med,2008,205（4）:897-913.

［6］尹国华,杨小英,张开明.荨麻疹患者血清中组胺、白介素2及可溶性白介素2受体水平的检测［J］.中华皮肤科杂志,2001,34（2）：138.

［7］李立红,董萍云,刘晓松.慢性荨麻疹患者血清白细胞介素-18和白细胞介素-10的检测［J］.中国皮肤性病学杂志,2007,21（1）：28-31.

［8］Ucmak D,Akkurt M,Toprak G,et al.Determination of dermatology life quality index,and serum C-reactive protein and plasma interleukin-6 levels in patients with chronic urticaria［J］.Postepy Dermatol Alergol,2013,30（3）:146-151.

［9］Raap U,Wieczorek D,Gehring M,et al.Increased levels of serum IL-31 in chronic spontaneous urticaria［J］.Exp Dermatol,2010,19（5）:464-466.

［10］Metz M,Krull C,Maurer M.Histamine,TNF,C5a,IL-6,-9,-18,-31,-33,TSLP,neopterin,and VEGF are not elevated in chronic spontaneous urticaria［J］.J Dermatol Sci,2013,70（3）:222-225.

［11］Ciprandi G,De Amici M,Legoratto S,et al.Serum IL-9 levels in patients with spontaneous urticaria:a preliminary study ［J］.J Investig Allergol Clin Immunol,2012,22（3）:232-234.

［12］Lotze MT,Matory YL,Ettinghausen SE,et al.In vivoadministration of purified human interleukin 2.II.Half life,immunologic effects,and expansion ofperipherallymphoid cells in vivo with recombinant IL 2［J］.J Immunol,1985,135（4）:2865-2875.

［13］李润祥,朱慧兰,梁碧华,等.荨麻疹患者外周血淋巴细胞亚群和 IL-15，IL-21，IgE 检测［J］.中国皮肤性病学杂志,2010,24（8）:708-711.

［14］朱慧兰,李润祥,郭庆,等.T、B、NK细胞亚型与慢性荨麻疹发病机制的关系［J］.中华皮肤科杂志,2008,41（6）:391-393.

［15］罗颖,晏洪波,周凌,等.慢性荨麻疹患者红细胞补体受体1分子表达及外周血IgE和补体C3、C4水平的相关性研究［J］.中华皮肤科杂志,2012,45（12）:855-858.

2015年英夫利西单抗（类克®）临床应用有奖征文通知

银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病，其患病率呈上升趋势，估计中国至少有600万银屑病患者。随着科学的进步和对疾病的认识，生物制剂已经成为治疗银屑病的新选择。为了促进皮肤科医师对生物制剂的认识和交流，西安杨森制药有限公司与中华皮肤科杂志编辑部联合举办英夫利西单抗（类克®）临床应用有奖征文活动。2014年征文收到数十篇高质量的文章，将择优刊登在中华皮肤科杂志上。本次征文活动得到皮肤科医师的欢迎，因此，从2015年继续进行有奖征文活动，旨在与皮肤科医生携手，交流生物制剂治疗银屑病的经验，共同促进银屑病治疗的发展。

一、征文范围：英夫利西单抗治疗重度斑块型银屑病的图片和内容展示。

二、征文要求：①未在公开出版的杂志上发表，未在全国性学术会议上交流；②应征论文写作格式请参考中华皮肤科杂志稿约要求；③至少提供患者3组照片，治疗前、2周、6周的照片；④请注明第一作者姓名、单位、职称、地址、邮编、电子邮箱以及联系电话；⑤只接受电子邮箱投稿（Word排版），征文电子版发至邮箱beauty_life2014@163.com，并注明“美丽人生征文”字样。所有征文恕不退稿，请自留底稿。征文截稿时间：2015年9月30日。

三、评选方法和奖项设置：由知名专家及相关专业专家组成评审委员会，对征文稿件进行评审。奖项设置：获前10名文章作者资助第一作者参加2016年中华医学会皮肤性病学学术年会；其余参与投稿第一作者，均赠阅中华皮肤科杂志2016年全年杂志。

英夫利西单抗（类克®）临床应用有奖征文揭晓

为了促进皮肤科医师对生物制剂的认识，西安杨森制药有限公司与中华皮肤科杂志编辑部在2014年联合举办“英夫利西单抗（类克®）临床应用有奖征文”活动，共收到征文数十篇。经专家组评审，最终评出一等奖3名，二等奖9名。现将获奖名单公布如下。一等奖：英夫利西单抗治疗重度银屑病17例临床观察（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院朱晨雨等）；英夫利西单抗治疗重度寻常性银屑病的疗效及对代谢综合征和动脉粥样硬化生化指标的影响：7例报告及文献复习（南方医科大学珠江医院皮肤科张堂德等）；类克成功治疗一例严重急性进行期银屑病患者（中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院陈敏等）二等奖：英夫利西单抗治疗重度斑块状银屑病一例（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院吴超等）；英夫利西单抗治疗红皮病性银屑病一例（浙江大学医学院附属第二医院皮肤科刘伦飞等）；英夫利西单抗治疗重度斑块状银屑病一例（浙江大学医学院附属第二医院皮肤科陈积愫等）；英夫利西单抗治疗斑块状银屑病一例（中山大学附属第五医院皮肤科陆东庆等）；类克治疗斑块状银屑病一例（华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科陶娟等）；英夫利西单抗治疗关节病性银屑病一例（广东省皮肤病医院王晓华等）；英夫利西单抗治疗脓疱性银屑病一例（南方医科大学南方医院皮肤科梁燕华）；英夫利西单抗治疗寻常性银屑病一例（南方医科大学南方医院皮肤科杨瑶）；英夫利西单抗治疗寻常性银屑病一例（南方医科大学南方医院皮肤科刘清秀）。

Expressions of interleukin-9 and the transcription factor PU.1 in peripheral blood of patients with chronic urticaria and their significance

Zhang Minghai,Dai Qianmei,Hu Chunyan,Chen Chen,Chen Peng.Department of Dermatology,Anhui No.2 Provincial People′s Hospital,Hefei 230000,China

ObjectiveTo investigate the relationship of interleukin-9（IL-9）and the transcription factor PU.1 with chronic urticaria.MethodsThirty patients with chronic urticaria （patient group）and 30 healthy volunteers（control group）were included in this study.Venous blood samples were collected from these subjects.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect serum levels of IgE,flow cytometry（FCM）to determine the percentage of CD4+IL-9+T cells,real-time fluorescence-based quantitative PCR （RTFQ-PCR）to measure the mRNA expressions of IL-9 and PU.1 in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）.Measurement data were compared between the two groups by independent-samplesttest,and relationship among these parameters was assessed by Pearson correlation analysis.ResultsThe expressions of IL-9 and PU.1 mRNAs in patients with chronic urticaria were significantly higher than those in healthy controls（4.44±1.90 vs.3.20±1.78,t=2.60,P＜0.05;3.26±1.59 vs.2.34±1.47,t=2.34,P ＜ 0.05）.Compared with the control group,the patient group showed increased percentage of CD4+IL-9+T cells in peripheral blood（0.63%±0.44%vs.0.22%±0.12%,t=5.04,P＜0.01）and serum IgE levels（（82.04±31.72）vs.（60.74 ± 28.26）IU/ml,t=2.75,P ＜ 0.01）.The percentage of CD4+IL-9+T cells and levels of IL-9 and PU.1 mRNAs in peripheral blood were all positively correlated with serum levels of IgE in these patients（r=0.596,0.767,0.746,respectively,allP ＜ 0.01）.ConclusionT helper type 9 （Th9）cells and IL-9 may take part in the occurrence of chronic urticaria.

Urticaria;Interleukin-9;Th9 cells

Zhang Minghai,Email:minghai77@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.012

230000合肥，安徽省第二人民医院皮肤科

张明海，Email：minghai77@sina.com

2014-01-22）

（本文编辑：尚淑贤）