氟芬那酸丁酯抑制紫外线诱导皮肤急性光毒性作用的研究

郭建美 仲少敏 陶荣 苗晓琳 吴艳

·论著·

氟芬那酸丁酯抑制紫外线诱导皮肤急性光毒性作用的研究

郭建美 仲少敏 陶荣 苗晓琳 吴艳

目的 探讨非甾体类抗炎药氟芬那酸丁酯（BT）对紫外线诱导皮肤急性光毒性反应的抑制作用及可能的作用机制。方法 SKH-1无毛小鼠背部随机编号分为6组，仅照光组、BT+照光组、照光+BT组、基质+照光组、照光+基质组、空白组。在处理后24 h收集各组皮肤标本，HE染色，用实时PCR检测caspase 3、p53、COX-2、PGER1、IL-1β、IL-6的表达量以及免疫荧光检测caspase 3的表达量。结果 照光后24 h，与仅照光组相比，涂抹BT软膏组皮肤水肿程度减轻，凋亡细胞的数目减少。实时PCR显示：与空白组相比，仅照光组caspase 3、p53、COX-2、PGER1、IL-1β、IL-6均有升高（P ＜ 0.05）；BT 软膏 + 照光组与仅照光组比较，caspase 3、p53、COX-2、PGER1、L-1β、IL-6表达明显下调（P ＜ 0.05），照光 +BT 软膏组仅 caspase 3、p53的表达明显下调（P＜0.05）。免疫荧光检测：仅照光组与空白组相比caspase 3表达明显上调；与仅照光组比较，BT软膏+照光组和照光+BT软膏组caspase 3表达显著下降。结论 BT可以部分抑制紫外线对于SKH-1无毛小鼠皮肤造成的急性光毒作用。

氟芬那酸；紫外线；光毒性皮炎；动物实验

紫外线（UV）照射可以引发一系列的皮肤损害，表现为日晒伤、色素加深、晒黑、免疫抑制、以及光敏性皮肤病等［1］。我们前期［2］的试验表明，外用非甾体抗炎药氟芬那酸丁酯（商品名布特，简称BT）有较好的预防紫外线诱导皮肤光毒性反应的作用，尤其是在光照前给药效果最好，作用优于外用糖皮质激素类药物和其他的外用非甾体抗炎药。因此，我们对无毛小鼠外用BT探讨其可能的光保护机制，以期为光线性皮肤病治疗提供新的思路。

资料和方法

一、资料

1．实验动物：8只SKH-1雄性无毛小鼠购自上海市公共卫生临床中心实验动物部（合格证号3100120502），6～8周龄，质量30 g左右。饲养于清洁级动物饲养室内，20～24℃，给予普通饲料和水饲养。

2．实验药物：5%氟芬那酸丁酯软膏和氟芬那酸丁酯基质均来自沈阳同联医药有限公司。

3.仪器：紫外线光疗仪（SS-IB型，发射311 nm窄谱UVB）购于德国Waldmann公司，Mastercycler gradient PCR仪购于美国Eppendorf公司，实时CR仪购于美国ABI公司，激光共聚焦显微镜购于德国Leica公司。

4.试剂：总RNA提取试剂盒购于美国Bio-Tek公司，反转录试剂盒、Sybr Green Mix购于北京全式金生物技术有限公司，兔抗鼠caspase 3抗体购于美国Biovision公司，FITC标记的山羊抗兔抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

5.引物序列：根据基因库得到各基因的mRNA序列应用Primer Express3.0软件设计所检测各项指标的引物（表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

二、方法

1.实验分组：将每只鼠的后背分为6个区域，随机编号给予下列处理。空白组：不做任何处理，观察24 h。仅照光组：UVB照射后观察24 h；BT+照光组：先涂抹BT，UVB照射后观察24 h；照光+BT：先在该区域进行UVB照射，然后涂抹BT，观察24 h；基质+照光组：先涂抹BT基质,UVB照射后观察24 h；照光+基质组：先在该区域进行UVB照射，然后涂抹BT基质，观察24 h。

2.给药方式：BT软膏和基质剂量为2 mg/cm2。涂药后30 min进行UVB照射或UVB照射后30 min涂药。因有基质组作为对照，不用擦去药物。

3.照射量：查阅文献 ［3］SKH-1无毛小鼠的MED值为UVB 160 mJ/cm2；紫外线光疗仪距离小鼠被测皮肤保持为23 cm，剂量1 440 mJ/cm2（9 MED）。

三、统计学分析

本研究所得数据应用SPSS16.0统计分析软件进行分析。多组间比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

结 果

一、UVB照射后各组小鼠皮肤的大体表现

UVB照射小鼠皮肤后24 h，肉眼观察各组表现，见图1。与空白组（C）相比，其余5组均表现出不同程度的水肿，未见明显红斑。而BT+照光组（A）和照光+BT组（B）水肿程度显著比其余3组轻。

二、UVB照射后各组小鼠皮肤的HE表现

UVB照射后24 h，各组小鼠皮肤进行HE染色，见图2。与空白组（2A）相比，仅照光组（2B）可见多个凋亡细胞（箭头，表现为嗜酸性胞质，核固缩）其余各组少见凋亡细胞。仅照光组（2B）和基质组（2E，2F）表皮细胞有不同程度的水肿。

三、皮肤组织的实时PCR检测

1.caspase 3的mRNA相对表达量：与空白组（1.04±0.42）相比，仅照光组 caspase 3（1.97±0.32）表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；BT+照光组（0.89±0.28）、照光+BT组（1.14±0.4）分别与仅照光组相比，caspase 3表达显著下降（P＜0.05）。

图1 UVB照射后24 h各组小鼠皮肤的表现 A：氟芬那酸丁酯（BT）+照光组：水肿反应不明显；B：照光+BT组：水肿反应不明显；C：空白组：无水肿反应；D：基质+照光组：明显水肿反应；E：照光+基质组：明显水肿反应；F：仅照光组：明显水肿反应

图2 UVB照射后各组小鼠皮肤表现（HE×400） 2A：空白组：表皮细胞无水肿，未见凋亡细胞；2B：仅照光组：表皮细胞明显水肿，见多个凋亡细胞，表现为嗜酸性胞质，核固缩（箭头）；2C：氟芬那酸丁酯（BT）+照光组：表皮细胞无明显水肿，未见凋亡细胞；2D：照光+BT组：表皮细胞无明显水肿，未见凋亡细胞；2E：基质+照光组：表皮细胞明显水肿，凋亡细胞少见；2F：照光+基质组：表皮细胞明显水肿，凋亡细胞少见

2.p53mRNA相对表达量：与空白组（1.08±0.35）相比，仅照光组 p53（1.49±0.19）表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；BT+照光组（0.70±0.29）、照光 +BT组（0.90±0.43）分别与仅照光组相比，表达显著下降（P＜0.05）。

3.COX-2、PGER1、IL-1β 和 IL-6 的mRNA相对表达量：与空白组相比，仅照光组COX-2、PGER1、IL-1β 和 IL-6 表达显著升高（P＜0.05）；BT+照光组与仅照光组相比，表达明显下降（P＜0.05）；照光+BT组与仅照光组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

四、皮肤活检组织直接免疫荧光检测

表皮内caspase 3含量由直接免疫荧光进行检测。见图3。与空白组相比，仅照光组表皮荧光强度明显增强，说明caspase 3表达明显升高；与仅照光组相比，BT+照光组和照光+BT组表皮荧光强度明显减弱，说明caspase 3表达量有明显下降。

讨 论

UVB照射皮肤后的光毒性反应，即皮肤日晒伤，表现为灼热、疼痛、水肿和红斑。UVB照射SKH-1无毛小鼠后虽然不会产生和人类皮肤那样明显的红斑反应，但会表现为皮肤明显水肿。本研究中，我们发现在接受紫外线照射前30 min涂抹BT时，可以明显抑制UVB的这种急性光毒作用，该结果与我们前期［2］的试验结果一致，证明外用BT具有光保护作用。

表2 各组炎症因子mRNA的表达情况（±s）

表2 各组炎症因子mRNA的表达情况（±s）

注：n=8。与仅照光组比较，a：P ＜ 0.05；b：P ＞ 0.05

组别 仅照光组 空白组 布特+照光组 照光+布特组COX-2 mRNA 8.01±3.11 1.18±0.74a 1.05±0.37a 4.14±2.10b PGER1 mRNA 5.58±2.20 1.60±1.20a 1.62±1.20a 2.80±1.30b IL-1β mRNA 2.70±1.32 1.25±1.07a 1.40±0.91a 2.53±1.30b IL-6 mRNA 7.49±3.23 0.82±0.40a 1.27±0.61a 5.76±2.30b

图3 各组caspase 3免疫荧光的表达情况 3A：空白组：表皮荧光信号强度弱，caspase 3表达量低；3B：仅照光组：表皮荧光信号强度强，caspase 3表达量高；3C：氟芬那酸丁酯（BT）+照光组：与仅照光组相比，表皮荧光信号强度较弱，caspase 3表达量明显下降；3D：照光+BT组：与仅照光组相比，表皮荧光信号强度较弱，caspase 3表达量有明显下降

UVB照射皮肤后主要发生凋亡和炎症［4］，这些反应是UVB导致光毒性反应的主要机制。UVB可以直接损害细胞DNA，产生环丁烷嘧啶二聚体［5］，当p53监测到这种不良信号会启动核苷酸切除进行修复［6］，如果修复失败，则会启动caspase 3通路诱导这些细胞的凋亡，以保证因紫外线照射而产生的突变和损伤不被复制。本研究发现，不论在接受紫外线照射前后，涂抹BT都可以减少UVB引起的角质形成细胞凋亡，伴有p53和caspase 3等参与凋亡的基因表达下调。这一作用与文献报道一致［7］，与黄芩苷的光保护作用机制也很相似［8］。紫外线照射皮肤后，角质形成细胞会分泌大量细胞因子、化学物质和生长因子等,可以引起细胞因子微环境的暂时性变化［9］。受损的角质形成细胞不仅自身分泌前炎症因子IL-1β，还会刺激邻近的角质形成细胞的分泌，扩大反应。IL-1β可以强效地刺激角质形成细胞释放前炎症因子IL-6。IL-6不仅可以启动急性期炎症反应，还可诱导中性粒细胞和肥大细胞向皮肤的趋化作用［10］。另外，环氧合酶2活化导致前列腺素2合成增加，前列腺素2是导致日晒伤特征性水肿和红斑反应的关键物质。同时，本研究发现，UVB照射后环氧合酶2、前列腺素2的受体PGER1表达显著升高；炎症因子IL-1β和IL-6都明显上调。而先涂抹BT软膏30 min后再接受紫外线照射的小鼠，环氧合酶2和前列腺素2的表达量明显下降，IL-1β和IL-6亦显著下调。说明BT软膏可以通过抑制环氧合酶2，减少前列腺素2的释放，还可减少炎症因子IL-1β和IL-6的生成，从而抑制紫外线所诱导的急性炎症反应。该结果与Rodriguez-Burford等［11］研究结果一致。本研究和之前的［2］试验均发现，BT在紫外线照射前30 min使用光保护效果最好，而照射后再涂药效果明显减弱。

声明 沈阳同联医药有限公司提供相应药品

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2015年复旦大学附属华山医院皮肤科举办国家级继续教育项目学习班通知

①真菌病研究新进展：4月6-10日，Ⅰ类学分10分。展示常见和少见真菌病的临床图片、诊断、治疗和实验室检查的新进展；②性病艾滋病临床诊治进展：4月20-24日，Ⅰ类学分10分。为获得性病艾滋病领域的新理论、新知识、新技术、新方法提供机会；③现代激光医学技术在皮肤科应用：5月4-8日，Ⅰ类学分10分。主讲激光基础、激光治疗色素性、血管性皮肤病；光子嫩肤、除皱、准分子激光、光动力学疗法；激光治疗浅表肿瘤、脱毛、副作用的防治等；④皮肤病与性病学进展：5月5-9日Ⅰ类学分10分。主讲各类皮肤病的新理论、新技术、新疗法，并组织疑难病例讨论；⑤皮肤组织病理新进展：5月11-17日，Ⅰ类学分10分。讲解皮肤组织结构、组织发生及基本病变，各种常见皮肤病及皮肤肿瘤、皮肤淋巴瘤等疾病的组织病理改变，并包括有关疾病的新进展、新内容。结合上课内容安排电脑彩色投影仪及多头显微镜读片、示教；⑥色素异常性皮肤病：5月25-29日Ⅰ类学分10分。主讲白癜风、黄褐斑的诊治以及光老化的诊断和治疗；⑦皮肤外科暨毛发移植的新进展：9月9-12日，Ⅰ类学分10分。讲解皮肤外科相关理念、皮肤良恶性肿瘤的治疗、Mohs显微描记手术的基本理论和基本技术、瘢痕疙瘩的发病机制及治疗、黑素瘤的分期与治疗、整形技术在皮肤外科的应用、微整形注射美容的应用、影像学在皮肤外科中的应用、毛发移植的进展、植发中心的运作、毛发移植围手术期护理等。以上各班学费500～1200元不等，详见正式通知。报名方式：上海市乌鲁木齐中路12号，复旦大学附属华山医院皮肤科於卿璐收，邮编200040，联系方式：13916291957或Email：185179591@qq.com。

Inhibitory effect of butyl flufenamate on ultraviolet-induced acute skin phototoxicity

Guo Jianmei,Zhong Shaomin,Tao Rong,Miao Xiaolin,Wu Yan.Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of butyl flufenamate（BT）on ultraviolet（UV）-induced acute skin phototoxic reaction,and to investigate its possible mechanisms.MethodsEight SKH-1 hairless mice were included in this study.The back of each SKH-1 hairless mouse was divided into six regions,which were then randomly classified into six groups:blank group receiving no treatment,UV group receiving UV radiation only,BT+UV group and vehicle+UV group topically treated with BT ointment and vehicle respectively followed by UV radiation,UV+BT group and UV+vehicle group topically treated with BT ointment and vehicle respectively after UV radiation.Skin samples were obtained from these mice at 24 hours after treatment.Subsequently,hematoxylin-eosin（HE）staining was performed,real-time PCR was carried out to detect mRNA expressions of caspase-3,p53,COX-2,PGER1,interleukin（IL）-1β,IL-6,and an immunofluorescence assay was conducted to observe the expression of caspase-3.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance（ANOVA）.ResultsCompared with the UV group,both BT+UV group and UV+BT group showed a decrease in the degree of skin edema and number of apoptotic cells at 24 hours after UV radiation.Real-time PCR showed that the mRNA expressions of caspase-3,p53,COX-2,PGER1,IL-1β and IL-6 were significantly higher in the UV group than in the blank group （allP＜0.05）,but significantly lower in the BT+UV group than in the UV group （allP＜0.05）,and only the expressions of caspase-3 and p53 mRNAs were significantly decreased in the UV+BT group compared with the UV group （bothP＜0.05）.The immunofluorescence assay revealed that the expression of caspase-3 increased in the UV group compared with the blank group,but decreased in both BT+UV group and UV+BT group compared with the UV group.ConclusionBT could partially inhibit UV-induced acute skin phototoxicity in SKH-1 hairless mice.

Flufenamic acid;Ultraviolet rays;Dermatitis,phototoxic;Animal experimentation

Wu Yan,Email:adelewu@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.011

100034北京大学第一医院皮肤科

吴艳，Email：adelewu@medmail.com.cn

2014-03-30）

（本文编辑：吴晓初）