黄褐斑患者皮损及血液中Toll样受体2和4的表达

王银娟 顾华 郭美华 涂颖 何黎

·论著·

黄褐斑患者皮损及血液中Toll样受体2和4的表达

王银娟 顾华 郭美华 涂颖 何黎

目的 探讨Toll样受体（TLR）2和4与黄褐斑发病的相关性。方法 黄褐斑患者和健康对照各40例，采集外周血，并收集其中10例黄褐斑及10例健康对照者皮损，用RT-PCR方法检测血样及皮损中TLR2和4 mRNA的表达，免疫组化观察TLR2和4在皮损中的表达及分布，并进行统计分析。结果 黄褐斑皮损中TLR2和TLR4在mRNA水平表达（分别为9.72±2.93，9.52±2.88）明显高于健康对照（分别为5.10±2.69，4.77±1.90），差异有统计学意义（分别t=3.67、4.36，均P＜0.01）。40例黄褐斑患者及40例健康对照外周血中TLR2和TLR4的表达，差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化显示：10例正常皮肤中6例表皮及血管内皮细胞均无TLR2表达，4例表皮基底层有TLR2弱阳性表达，血管内皮细胞未见表达。10例黄褐斑皮损中有3例表皮全层均有TLR2阳性表达，7例基底细胞层及棘层有TLR2阳性表达，真皮浅层血管内皮细胞未见TLR2表达。10例健康对照皮肤表皮及血管内皮细胞均未见TLR4表达。10例黄褐斑皮损基底细胞层均有TLR4强阳性表达，棘层弱阳性表达，其中3例真皮浅层血管内皮细胞可见阳性TLR-4表达。结论 黄褐斑发病可能与局部皮肤TLR介导的炎症反应有关。

黄褐斑；Toll样受体；炎症

黄褐斑为女性最常见的面部皮肤病之一，严重影响容貌，然而病因及发病机制尚不完全清楚，目前认为与紫外线、化妆品、妊娠、内分泌紊乱、某些慢性疾病、某些药物、睡眠质量及遗传等有关。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是一种天然免疫的分子家族，不仅在免疫细胞和炎症细胞表面表达，多种组织细胞，如，角质形成细胞及黑素细胞均有TLR表达。以往研究证实，TLR在多种与炎症相关的疾病，如，银屑病、痤疮、特应性皮炎、系统性红斑狼疮等的发病机制中产生作用［1-3］。为了探讨TLR介导的免疫反应在黄褐斑发病中的作用，我们研究TLR2和TLR4在黄褐斑患者及健康人皮损及血液中的表达。

对象与方法

一、对象

2012年1月至2013年6月在昆明医科大学第一附属医院皮肤科门诊，根据黄褐斑的诊断标准［4］，收集女性黄褐斑患者皮损10例，均为面颊部长径约1 cm的楔形皮损；另外收集女性色素痣切除皮损周围正常皮肤样本10例，均为女性面颊部长径约1 cm的楔形皮损。采集黄褐斑患者血样40例为黄褐斑组，本院体检中心健康血样40例为健康对照组，均为女性。采集标本过程中均排除其他系统疾病。黄褐斑组与健康对照组年龄差异无统计学意义。本研究经过本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

二、主要试剂和仪器

TLR2/TLR4抗体（美国Abnova公司），偶联辣根过氧化物酶的二抗及DAB显色剂（丹麦Dako公司），皮损/全血RNA提取试剂盒（美国Qiagen公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA合成试剂盒（加拿大 Fermentas公司），SYBR Green Master（瑞士Roche公司），PCR仪（美国Bio-Rad公司），实时定量PCR仪（美国ABI公司）。

三、方法

1.实时定量PCR：引物由广州Invitrogen公司合成，序列：TLR2：上游 5′-ATCCTCCAATCAGGCT TCTCT-3′，下游 5′-GGACAGGTCAAGGCTTTTTAC A-3′；TLR4：上游 5′-AGTTGATCTACCAAGCCTTGA GT-3′，下游 5′-GCTGGTTGTCCCAAAATCACTTT-3′；GAPDH：上游 5′-AAAGGGTCATCATCTCTG-3′，下游5′-GCTGTTGTCATACTTCTC-3′。将约 0.1 g 皮肤组织加入Trizol裂解液中，冰浴研磨至无颗粒匀浆液，使用RNA提取试剂盒，通过核酸定量仪检测RNA浓度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA第一条链，定量PCR检测。吸取抗凝管中的血液1.5 ml放入去酶离心管，提取总RNA，通过核酸定量仪检测RNA浓度。用试剂盒合成cDNA第一条链，定量PCR检测。

2.免疫组化：皮损常规石蜡组织包埋、切片，脱蜡至脱水。3%过氧化氢去离子水消化，枸橼酸缓冲液抗原修复。正常羊血清封闭，室温孵育。滴加单克隆TLR2/TLR4抗体孵育，继以二抗。滴加生物素二抗，DAB显色。水洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。结果判定：胞膜棕黄色染色判定为阳性。

3.统计学分析：用SPSS 11.0统计软件作数据处理。各组间数据比较采用独立样本t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、TLR2和TLR4在皮损中的表达

黄褐斑患者皮损中，TLR2和TLR4在mRNA水平表达（分别为9.72±2.93，9.52±2.88）明显高于健康对照者（分别为 5.10±2.69，4.77±1.90），差异有统计学意义（t=3.67、4.36，均 P ＜ 0.01），见表 1。免疫组化显示，10例健康皮肤中6例表皮及血管内皮细胞均无TLR2表达（图1），有4例表皮少量基底层细胞胞膜TLR2弱阳性表达，血管内皮细胞未见表达（图2）10例黄褐斑皮损中有3例表皮全层均有TLR2阳性表达（图3），7例仅基底细胞层及棘层胞膜有TLR2阳性表达，真皮浅层血管内皮细胞未见TLR2表达（图4）。10例健康皮肤表皮及血管内皮细胞均未见TLR4表达；10例黄褐斑皮损基底层细胞胞膜均有TLR4强阳性表达，棘层弱阳性表达（图5），其中3例真皮浅层血管内皮细胞可见阳性TLR-4表达（图6）。

二、TLR2和TLR4在血液中的表达

黄褐斑组与健康对照组比较，TLR2和TLR4表达差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

讨 论

近年来，TLR在皮肤病中的研究成为热点，其受微生物和细胞因子的调节，主要通过识别病原微生物表面的病原体及配体，介导炎症反应，释放大量炎症因子［5-6］。其中TLR2和TLR4是一种具有广谱识别能力的“模式”识别受体，主要识别革兰阳性菌和革兰阴性菌的标记蛋白，在防御表皮微生物的免疫反应中起到重要作用［7］。TLR2主要见于单核细胞、树突细胞和中性粒细胞，TLR4主要见于巨噬细胞、内皮细胞、树突细胞和中性粒细胞。

关于黄褐斑的发病机制，以往研究主要集中在表皮层黑素细胞的数量、活力，以及黑素颗粒的分布上，内在因素及外界因素对黑素细胞的刺激最终导致黑素细胞数量不变而黑素合成能力增加，包括局部微生态环境失衡，尤其是褐色素、枯黄色素的微球的显著增加［8］，以及黑素细胞受到肿瘤坏死因子α、内皮素、白三烯等炎症介质刺激后，可改变黑素细胞及一些免疫细胞的活性使黑素合成增加［9-11］研究 表 明 ， 黑素 细 胞 中 TLR1、2、3、4、6、7、9 在

图1 健康皮肤表皮及血管内皮细胞均无表达（DAB染色×200）

图2 健康皮肤表皮少量基底层细胞胞膜有少量棕色染色，TLR2弱

图3 黄褐斑皮损表皮全层细胞胞膜均有棕色染色，TLR2阳性表达（DAB染色×200）

图4 黄褐斑皮损仅基底细胞层及棘层细胞胞膜有棕色染色，TLR2阳性表达，真皮浅层血管内皮细胞未见表达（DAB染色×200）

图5 黄褐斑皮损基底层细胞胞膜均有TLR4棕色染色，强阳性表达，棘层细胞胞膜淡棕色染色，弱阳性表达（DAB染色×200）

图6 黄褐斑皮损基底层细胞胞膜及真皮浅层血管内皮细胞可见棕色染色，TLR-4呈阳性表达表达（DAB染色×100）

表1 黄褐斑组与健康对照组皮损和血TLR2、4的检测结果

阳性表达，血管内皮细胞未见表达（DAB染色×200）mRNA水平上的表达，蛋白水平上证明TLR2、4、7和9的表达［12］。因此，我们推测，黄褐斑的炎症反应可能与TLR介导的免疫反应相关。

国外学者对健康人皮肤TLRl～5的分布情况进行了研究，发现健康人表皮表达TLRl、TLR2、TLR5，而TLR3和TLR4几乎检测不到，本实验发现健康人皮肤TLR2弱表达而无TLR4表达与国外研究结果类似［13］，而TLR2和TLR4在黄褐斑皮损中表达阳性，黄褐斑患者的黑素细胞中TLR2和TLR4的表达相对健康人有所上调，提示黄褐斑的形成可能与TLR介导的相关信号传导产生炎症因子，增加黑素的合成有关。研究结果显示，紫外线诱导的内皮细胞因子1，前列腺素及干细胞因子1分泌增多可使黑素细胞中黑素小体合成增多并促使其自角质形成细胞转运［14-15］。提示，紫外线诱导的炎症反应在色素形成过程中发挥重要作用。另外，在一些炎症疾病中，肿瘤坏死因子α、γ干扰素等炎症因子也可上调Toll样受体的表达［16］，提示黄褐斑皮损中TLR2和TLR4表达增加也可能与紫外线照射等刺激产生的炎症因子升高有关。我们的结果还显示，黄褐斑患者及健康人群血液TLR2和TLR4的mRNA表达比较，差异无统计学意义，提示免疫反应在黄褐斑的发病机制中无影响。

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Expressions of Toll-like receptors 2 and 4 in skin lesions and peripheral blood from patients with chloasma

Wang Yinjuan*,Gu Hua,Guo Meihua,Tu Ying,He Li.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China.

ObjectiveTo investigate the relationship of Toll-like receptors （TLRs）2 and 4 with the occurrence of chloasma.MethodsPeripheral blood samples were collected from 40 patients with chloasma and 40 healthy human controls,and skin samples were also collected from the lesions of 10 of the patients and normal skin of 10 of the healthy controls.Real time （RT）-PCR was performed to measure the mRNA expressions of TLR2 and TLR4 in skin lesions and blood samples.An immunohistochemical test was conducted to observe the expressions of TLR2 and TLR4 in skin lesions.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsThe expressions of TLR2 and TLR4 mRNAs were both significantly higher in skin lesions of the patients than in normal skin of the controls（9.72±2.93 vs.5.10±2.69,t=3.67,P＜0.01;9.52±2.88 vs.4.77±1.90,t=4.36,P＜0.01）,while no significant difference was found in the mRNA expressions of TLR2 or TLR4 in peripheral blood between the patients and controls（bothP＞0.05）.As the immunohistochemical test revealed,TLR2 was absent in both the epidermis and vascular endothelial cells in 6 normal control skin samples,weakly expressed in the basal layer of the epidermis but absent in vascular endothelial cells in 4 normal skin samples,and no TLR4 expression was observed in either the epidermis or vascular endothelial cells in these control skin samples.Among the 10 skin samples from chloasma lesions,3 showed TLR2 expression in the whole epidermis,7 in both basal cell layer and prickle cell layer but not in vascular endothelial cells in the superficial dermal layer,all showed strong TLR4 expression in the basal cell layer and weak TLR4 expression in the prickle cell layer,and 3 exhibited TLR4 expression in vascular endothelial cells in the superficial dermal layer.ConclusionTLR-mediated immune responses in local skin might be related to the occurrence of chloasma.

Chloasma;Toll-like receptors;Inflammation

He Li,Email:helikm2662@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.010

教育部2013年度创新团队发展计划（IRT13067）；云南省卫生高层次人才培养计划（L-201211）；2012年中华医学会薇姿研究项目（V2012080514）

650032昆明医科大学第一附属医院皮肤科（王银娟、顾华、涂颖、何黎）；昆明医科大学科技处（郭美华）

何黎，Email：helikm2662@126.com

2014-05-23）

（本文编辑：吴晓初）