季铵盐化纳米金刚石肌红蛋白修饰电极的电化学行为

马晓玲　丁承君　张璞　郭玮　罗红霞

摘要通过一系列的化学反应对纳米金刚石（ND）表面进行修饰，成功制备了季铵盐化纳米金刚石： NDCONHCH2CH2N（CH3）3+·I Symbolm@@ （QASND），通过FTIR、元素分析、电化学等手段对目标产物QASND进行了表征。将肌红蛋白（Mb）与QASND混合液滴加在玻碳（GC）电极表面，制备QASND/Mb/GC修饰电极。在0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液 （pH 7.0）中，固定在膜内的Mb表现出良好的直接电化学性质，并显示了很好的稳定性。同时，探讨了此修饰电极表面固定的Mb对H2O2的催化还原，结果表明，此修饰电极可作为H2O2生物传感器，实现对H2O2的快速、准确检测，检出限为 3.5 μmol/L （S/N=3）。

关键词季铵盐化纳米金刚石；肌红蛋白；化学修饰电极；循环伏安法；过氧化氢

1引言

纳米金刚石（ND）是纳米材料家族中的重要成员，它不仅具有纳米材料的独特性质，还保留着金刚石优异的电化学性能，如电位窗口宽、背景电流低，高的化学、电化学稳定性和优越的抗腐蚀性等，同时由于其巨大的比表面积、表面大量的含氧官能团＼[1，2＼]使它成为一种优良的电极材料。但是由于尺寸效应、表面效应、表面电子效应和近距离效应， 使ND容易发生团聚，阻碍了它在一些领域的应用，ND的表面修饰为ND解团聚进而提高其电化学性能提供了一种很好的解决方案。

由爆轰法制备的ND表面带有大量官能团，如COOH， OH，CO等，因而可以通过一系列的化学反应使其表面引进新的官能团，改善其性能，增强它的电化学活性。关于ND的表面修饰，已有较多研究。Liu等＼[3＼]将ND氟化，再将其烷基化、氨基化；Tkachenko等＼[4＼]将ND表面巯基化后，使它能够在金表面单层自组装，开拓了ND在电镀及纳米电子领域的应用； Krueger等＼[5＼]将ND硼烷化后，再与3氨基丙基三甲氧基硅烷反应，生成带有硅氧键的ND， 然后共价接枝生物素，并研究它与HRPSA的结合活性，为ND在医学领域以及电化学传感器领域的应用奠定基础；Mochalin等＼[6，7＼]将ND羧基化、酰氯化后，接上十八烷基胺，生成的带有长碳链ND产物可以较均匀分散在有机溶剂中，并在紫外光下发出蓝色的荧光，为其作为药物载体提供了可能。

肌红蛋白（Mb）是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质。Mb是组成骨骼肌和心肌的主要蛋白质，位于肌肉的肌细胞中，其功能是可逆地结合氧气，将氧气贮存于肌肉细胞中。Mb表现出的生理功能及参与的代谢过程，大多数涉及电子传递过程，因此用电化学方法研究 Mb的氧化还原反应及类酶性质，具有得天独厚的优势。同时，Mb由于相对便宜易得，是研究血红素蛋白质和酶的电子传递反应的理想模型物＼[8＼]。在过去的几十年中，人们通过各种努力将Mb固定到不同的修饰电极表面来研究其直接电化学＼[9＼]。最近， Mani等＼[10＼]将还原的氧化石墨烯多壁碳纳米管/Pt纳米粒子纳米复合材料与Mb一起修饰到玻碳（GC）电极表面，得到了Mb的直接电化学响应，并研究了该修饰电极对H2O2和NO

2的传感作用。但是，Mb在ND表面的电化学行为尚未见报道。

本课题组报道过ND修饰电极的电化学性质及其对某些生物分子电极反应的促进作用＼[11＼]。本研究通过一系列化学反应，对ND进行表面修饰，制备出季铵盐化ND（QASND）： NDCONHCH2CH2N（CH3）+3·I

然后将QASND分散到Mb溶液中，以滴涂方式制成 QASND/Mb/GC 修饰电极，研究了修饰电极中Mb的直接电化学行为，及对H2O2的电化学传感作用。

2实验部分

2.1仪器与试剂

红外光谱仪（BioRad FTS 6000），元素分析仪（Elementar Vario MICRO CUBE， Germany），Epsilon电化学工作站（美国BAS公司），pH 计（（Sartorius PB10， Germany）。三电极系统： 工作电极为GC或修饰后的GC电极（

参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt丝电极

纳米金刚石（ND， 深圳市金刚源新材料发展有限公司赠送）； N，N二甲基乙二胺、碘甲烷、二氯亚砜（分析纯）， 使用前重蒸； 马心肌红蛋白 （Mb， MW 17800），Nafion （2% Ethanol solution）， 购自Sigma公司； H2O2（30%），0.1 mol/L KH2PO4Na2HPO4缓冲溶液（PBS）作为支持电解质，电位扫描速率为100 mV/s （特殊指明除外），实验前均用高纯N2除氧20 min，实验用水为MilliQ去离子水（Millipore公司）。

2.2QASND的制备

2.2.1ND的羧基化ND表面除了带有大量的含氧基团之外，还会带有大量可活化的甲基或亚甲基基团，所以在使用前要经过酸化氧化处理，以增加其表面的羧基含量。将100 mg ND溶在50 mL H2SO4HNO3（9∶1， V/V）中，90 ℃时回流氧化7 d，再用去离子水反复洗涤至中性，在真空干燥箱中烘干得到羧基化ND，即NDCOOH。反应如下：

NDH2SO4HNO3（9∶1）refluxNDCOOH（1）

2.2.2ND的酰氯化 将NDCOOH与20 mL重蒸后的二氯亚砜（SOCl2）中，在90℃条件下加热回流24 h，使其表面的羧基酰氯化，反应完成后将所得产物用旋转蒸发仪旋干， 置于真空干燥箱中干燥备用。所得产物即酰氯化的ND（NDCOCl）。

2.2.3ND的酰胺化经真空干燥的NDCOCl与5 mL N，N二甲基乙二胺混合后在氮气保护下，加热至约100℃ 搅拌反应96 h。产物离心后得到的固体物用乙醇和去离子水多次洗涤，离心，得到固体＼[NDCONHCH2CH2N（CH3）2＼]， 即AND，在真空干燥箱中烘干。反应如下：

NDCOOH+NNH2N2100 ℃， 96 hCONDNHNAND（2）

2.2.4ND的季铵盐化经真空干燥的AND与1 mL 碘甲烷在新蒸丙酮溶液中加热至75℃ 搅拌回流24 h。离心后用乙醇洗涤多次，得到固体＼[NDCONHCH2CH2N（CH3）3+·I

2.3修饰电极的制备

称取10 mg Mb溶于1 mL去离子水中，取1 mg QASND分散于上述溶液中，超声混合均匀。玻碳电极用0.3 μm的氧化铝粉末抛光，然后分别用去离子水和无水乙醇超声清洗。用微量进样器取3 μL上述混合液滴加到预先处理好的GC电极表面，自然晾干。为防止Mb溶解于水中，滴加2 μL 2% Nafion乙醇溶液到电极表面，待溶剂挥发完全后即得到Nafion/QASND/Mb/GC修饰电极。用类似方法可以分别制得Nafion/QASND/GC修饰电极和Nafion/Mb/GC修饰电极。

3结果与讨论

3.1QASND的表征

是羰基的振动吸收峰。在1300～1500 cm处复杂的吸收谱带是CN，NH和COC等基团的谱峰相互叠加的结果＼[12＼]，这也说明ND表面本身含有一定量的N元素＼[18＼]。ND表面修饰前后FTIR图谱的变化表明ND已经季铵盐化。3.1.2元素分析表征表1是 ND和QASND的元素分析结果。从表1可见，QASND的N元素和H元素含量都约为ND的N元素和H元素含量的2倍，进一步证明季铵盐已经连接到ND上。3.1.3电化学方法表征将GC电极、ND膜修饰电极、QASND膜修饰电极浸泡在5 mmol/L K3Fe（CN）6溶液中5 min，将电极取出，用去离子水反复冲洗电极表面，然后分别在空白PBS中进行循环伏安扫描。如图2A所示，GC电极上没有任何氧化还原峰，说明裸电极对K3＼[Fe（CN）6＼]的吸附作用很弱；ND膜修饰电极上出现一对氧化还原峰，但是峰电位差较大，峰电流较小，可逆性很差，表明ND与 K3＼[Fe（CN）6＼]之间的作用力较弱，吸附在修饰电极表面的K3＼[Fe（CN）6＼]的量较小；QASND膜修饰电极上出现了一对非常可逆的氧化还原峰，峰电位差较小，峰电流很大，说明QASND与 K3＼[Fe（CN）6＼]之间的作用力很强，K3＼[Fe（CN）6＼]很容易吸附在QASND表面，这可能是因为QASND表面带正电荷，Fe（CN）6带负电荷，通过正负电荷之间强的静电作用，K3＼[Fe（CN）6＼]很好地固定在电极表面。这也进一步说明季铵盐已经连接在ND上，表面带正电荷，从而能够通过强的静电作用吸附K3＼[Fe（CN）6＼]。考察了电位扫描速率对Nafion/QASND/Mb/GC中Mb电化学行为的影响，图4为扫速分别是100， 200， 300， 400， 500和600 mV/s时的循环伏安图。随着扫描速率的增大，峰电位没有明显变化，峰电流逐渐增大。继续逐步加大扫速至2.0 V/s，峰电位依然没有明显变化，峰电流与扫描速率的关系如图4内插图所示，还原和氧化峰电流均与扫描速率呈线性关系，线性方程分别为IPc （μA）=2.5836v（V/s） + 0.1259 （r=0.999） 和通过红外光谱、元素分析实验及电化学手段进行表征，证明合成了目标产物QASND。将QASND与Mb混合滴加在玻碳电极表面，并以Nafion膜进行保护，制备了Nafion/QASND/Mb/GC修饰电极，实现了Mb活性中心与电极间的直接电子转移。进一步的实验表明，Nafion/QASND/Mb/GC修饰电极对O2以及H2O2具有灵敏的电化学传感作用，可作为H2O2生物传感器，实现对H2O2的快速、准确检测，检出限为3.5 μmol/L （S/N=3）。与其它类似修饰电极＼[9，10＼]相比，Nafion/QASND/Mb/GC电极修饰制备简单，原材料ND价廉易得，便于推广和应用。References

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10Mani V， Dinesh B， Chen S M. Saraswathi R. Biosens. Bioelectron.， 2014， 193（53）： 420-427

11Li Y S， Luo H X， Dai L M， Guo W， Li S N， Guo Z X. Sci. Chin. Chem.， 2012， 55（11）： 2445-2449

12JIANG XiaoHong， WANG ZhiCheng， HUANG YinSheng， YANG XuJie， Aleksahdrovich S V， LU LuDe， WANG Xin. J. Nanjing University Sci. Tech.， 2007， 31（4）： 523-527

江晓红， 王志成， 黄寅生， 杨绪杰， Aleksahdrovich S V， 陆路德， 汪 信. 南京理工大学学报， 2007， 31（4）： 523-527

13Miao X， Liu Y， Gao W C， Hu N F. Bioelectrochem.， 2010， 79（2）： 187-192

AbstractThrough a series of chemical reactions， a kind of quaternary ammonium salt derivative of nanodiamond， NDCONHCH2CH2N（CH3）3+ ·I

Symbolm@@ （QASND），was obtained ， which was confirmed by FTIR， element analysis experiment and the electrochemistry measurements. Mixed myoglobin （Mb） and QASND solution was dropped on the surface of the glassy carbon （GC） electrode to prepare QASND/Mb/GC modified electrode. In 0.1 mol/L phosphate buffer solution （PBS） （pH 7.0）， Mb in the membrane exhibited direct electrochemical properties and showed good stability. The electrocatalytic property of the modified electrode toward H2O2 was investigated， the results showed that the modified electrode could be used as the H2O2 biosensor to achieve fast， accurate detection of H2O2， with a detection limit of 3.5 mmol/L （S/N=3）.

KeywordsQuaternarized nanodiamond； Myoglobin； Chemically modified electrode； Cyclic voltammetry； Hydrogen peroxide

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