紫花牡荆素对H446细胞系肺癌干样细胞球形成能力和p-Akt蛋白表达的影响

易恒仲，龙灵芝，周 源，杨小红，曹建国，陈 蓉

（1.湖南省胸科医院，长沙 410013；2.湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

紫花牡荆素对H446细胞系肺癌干样细胞球形成能力和p-Akt蛋白表达的影响

易恒仲1，龙灵芝2，周 源2，杨小红2，曹建国2，陈 蓉2

（1.湖南省胸科医院，长沙 410013；2.湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

目的：研究紫花牡荆素（canstin，CAS）抑制人小细胞肺癌H446细胞系肺癌干细胞样细胞球形成作用，探讨其作用机制是否涉及降低Akt磷酸化蛋白表达水平。方法：肿瘤球形成法获得H446细胞系第2代球形成细胞，并检定CAS、及与LY294002合用对肿瘤球形成率的影响。Western blot分析p-Akt、Akt蛋白表达。结果：CAS以浓度依赖方式降低H446细胞系第2代球形成细胞肿瘤球形成率和Akt蛋白磷酸化水平。LY294002（5.0μmol/L）增强CAS抑制球形成以及下调p-Akt蛋白表达作用。结论：CAS具有抑制H446细胞系干细胞样细胞球形成作用；Akt特异性抑制剂有效增强CAS抑制肺癌干细胞样细胞球形成与Akt蛋白磷酸化。

紫花牡荆素，小细胞肺癌，肺癌干细胞样细胞，自我更性，p-Akt

小细胞肺癌是一种具有高度侵袭性的神经内分泌肿瘤，普遍预后不良［1］。为了解释肿瘤组织的细胞异质性，人们提出肿瘤干细胞学说［2］：肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化潜能，这使得肿瘤干细胞能够重构原发性肿瘤组织的细胞异质性。肿瘤干细胞学说为肺癌发病机制和药物防治研究提供了新的途径。我们先前的研究证实：干细胞条件培养基超低粘附板悬浮培养得到的球形成细胞（sphere forming cells，SFCs）具有自我更新和高致瘤性等肺癌干细胞样细胞功能和特性，并SFCs 组成性活化Akt［3］。新近，我们研究团队报道：中药蔓荆子主要活性成分紫花牡荆素（casticin，CAS）通过失活Akt抑制非小细胞肺癌A549细胞系肺癌干细胞样细胞肿瘤球形成［4］。因此，本文研究的主要目的是检测CAS抑制人小细胞肺癌H446细胞系干细胞样细胞球形成能力作用，探讨其作用机制是否涉及降低Akt磷酸化蛋白表达水平。

1　资料与方法

1.1药品与试剂 CAS相对分子量为374.3，淡黄色粉末，购自成都普瑞法科技开发公司（纯度＞ 98%，中国成都市）。Akt 抑制剂LY294002购自美国Sigma Aldrich公司。鼠抗人p-Akt（ser473）和Akt 单克隆抗体为美国Cell signaling 公司产品；鼠抗人β-actin 单克隆抗体购自美国Sigma Aldrich公司。

1.2细胞系与肿瘤球形成法 人小细胞肺癌细胞系NCI-H446细胞系购自中国科学院细胞库（中国上海市）。细胞添加10%胎牛血清DMEM培养基培养。参照文献［3］方法测定肿瘤球形成率。简言之，收集细胞，用添加100 IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、20 ng/ml人重组表皮生长因子（hrEGF）、10 ng/ml 人重组碱性成纤维细胞生长因子（hrbFGF）、不含维生素A的2% wt/vol B27 以及 1% wt/vol N2 添加物（美国Invitrogen公司）的无血清DMEM/F12培养基，以1000细胞/孔的密度接种于超低粘附6孔板（Corning Inc.，Corning，NY，USA）。每3天添加1次等量上述生长因子。培养6天，在Nikon Eclipse TE2000-S显微镜下计数肿瘤球的个数，并计算肿瘤球形成率：每孔肿瘤球均数/接种活细胞数×100%。体外连续成球培养：通过温和离心收集细胞，并将细胞分散成单细胞悬液，然后，用上述干细胞条件培养基悬浮培养，使其再形成新肿瘤球。取第2代球形成细胞用于所有实验。

1.3Western blot 按先前文献［3］描述完成蛋白印迹分析。抗p-Akt、抗Akt和抗β-actin抗体被用作一抗。细胞在4℃条件下，用RIPA裂解液（中国上海Invitrogen公司）孵育20分钟裂解。Bio-Rad含量测定系统测定蛋白浓度。总蛋白经SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美国Millipore公司）上。用ECL高级蛋白印迹分析系统（美国Amersham Pharmacia Biotech 公司）检测信号。

1.4统计学分析 使用SPSS 20.0 软件包（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）建立数据库。数据以均值±标准差（mean±SD）表示。采用one-way ANOVA 分析，首先进行方差齐性检验，在确认方差齐性后，使用LSD法进行組与组之间均数的比较；方差不齐时，应用Tukey法进行組与组之间均数的比较。P＜0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.1CAS对H446细胞系肺癌干样细胞球形成能力的影响 肿瘤球形成法检测不同浓度CAS（1.0、5.0和10.0μmol/L）对人小细胞肺癌H446细胞系第2代球形成细胞自我更新能力的影响。如图1所示：CAS以浓度依赖方式降低H446细胞系肺癌干样细胞肿瘤球形成率（P＜0.05）。

图1　紫花牡荆素降低肺癌干样细胞球形成率与溶媒（0.1% DMSO）对照组比较，*P＜0.05；与1.0μmol/L 紫花牡荆素（casticin）处理组比较，#P＜0.05

2.2CAS对H446细胞系肺癌干样细胞p-Akt蛋白表达的影响 Western blot分析CAS（1.0、5.0和10.0μmol/ L）对人小细胞肺癌H446细胞系第2代球形成细胞Akt磷酸化水平的影响。结果显示，CAS明显降低H446细胞系肺癌干样细胞磷酸化水平（图2）。

图2　紫花牡荆素下调肺癌干样细胞p-Akt蛋白表达

2.3LY294002对CAS抑制H446细胞系肺癌干样细胞球形成作用的影响 鉴于如上实验研究表明，CAS具有抑制H446细胞系肺癌干样细胞肿瘤球形成作用以及我们先前的研究证明，Akt特异性抑制剂LY294002以剂量依赖方式抑制H446细胞系细胞自我更新［3］。因此，我们寻求检定LY294002是否能有效增强CAS抑制H446细胞系肺癌干样细胞肿瘤球形成作用。结果证实，LY294002（5.0μmol/L）分别与CAS（1.0、5.0和10.0μmol/L）合用较两者各自单独处理下降H446细胞系肺癌干样细胞肿瘤球形成率作用更有效（图3）。

图3　LY294002增强紫花牡荆素降低肺癌干样细胞球形成率作用与各自的溶媒（0.1% DMSO）对照组比较，*P＜0.05；与相同浓度紫花牡荆素（casticin，CAS）处理组比较，#P＜0.05。

2.4Y294002对CAS下调H446细胞系肺癌干样细胞p-Akt蛋白表达的影响 基于如上实验研究结果发现，CAS能有效降低H446细胞系肺癌干样细胞Akt磷酸化水平，我们接下来分析Akt特异性抑制剂LY294002是否能协同CAS下调抑制第2代球形成细胞p-Akt蛋白表达。结果显示，LY294002（5.0μmol/L）分别与CAS（1.0、5.0和10.0μmol/L）合用下调H446细胞系肺癌干样细胞p-Akt蛋白表达作用更明显（图4）。

图4　LY294002增强紫花牡荆素下调肺癌干样细胞p-Akt蛋白表达作用

3　讨论

各类恶性肿瘤中发现含有肿瘤干细胞亚群，但在小细胞肺癌，肿瘤干细胞表面标志物还未获得公认。因此，在本文的研究中，我们揭示小细胞肺癌H446，细胞系细胞在非贴壁生长条件下能够形成肿瘤球，这与先前的研究结果一致［3］。

磷脂-3-激酶（PI3K）/AKT是一条有效的促存活信号通路，能介导包括小细胞肺癌细胞在内的各种癌细胞对化疗药物以及放疗促进凋亡的耐受性［5］。已有研究报道包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌以及胰腺癌等多种肿瘤中，AKT组成性活化［6］。West等研究表明55%肿瘤中AKT高度活化，这使得AKT成为热点研究靶标［7］。此外，大多数癌症耐药是因为PI3K/AKT途径活化。例如，紫杉醇［8］、阿霉素［9］在乳腺癌，吉西他滨在胰腺癌［10］均耐药，是因为PI3K/AKT途径高度激活。在先前的研究中，我们证实：Akt磷酸化抑制剂（或称PI3K抑制剂）LY294002能有效抑制肺癌干样细胞自我更新和降低Akt磷酸化水平［3］。本文的研究发现：中药蔓荆子主要活性成分紫花牡荆素以浓度依赖方式降低小细胞肺癌H446细胞系球形成细胞的肿瘤球形成率，同时，明显下调Akt磷酸化蛋白表达。说明，紫花牡荆素具有抑制小细胞肺癌干样细胞自我更新能力作用，其作用机制可能涉及其下调Akt磷酸化蛋白表达。这些结果与我们在非小细胞肺癌A549细胞系球形成细胞实验研究的发现相符［4］。

值得注意的是，本文的实验研究结果表明，LY294002（5.0μmol/L）使得紫花牡荆素降低小细胞肺癌干样细胞Akt磷酸化水平作用更加明显，同时，增强紫花牡荆素抑制小细胞肺癌H446细胞系球形成细胞自我更新能力作用。这些研究结果说明，紫花牡荆素可能通过不同于PI3K抑制剂LY294002的作用方式下调小细胞肺癌H446细胞系球形成细胞Akt磷酸化蛋白表达，进而抑制肿瘤球形成。因此，本文的研究强调了阻断PI3K/Akt信号传导增强紫花牡荆素抑制人小细胞肺癌H446细胞系干样细胞自我更新能力作用性质。

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［2］ Reya SJ， Morrison MF， Clarke IL. Weissman， Stem cells， cancer， and cancer stem cells［J］. Nature， 2001， 414: 105-111.

［3］ 易恒仲， 龙灵芝， 周源， 等. LY294002 抑制小细胞肺癌干细胞样细胞自我更新［J］. 湖南师范大学学报（医学版）， 2013， 10（1）: 15-18.

［4］ Liu F， Cao X， Liu Z， et al. Casticin suppresses self-renewal and invasion of lung cancer stem-like cells from A549 cells through down-regulation of pAkt［J］. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai）， 2014， 46（1）: 15-21.

［5］ Wang L， Liu XK， Shi XQ. Involvement of Akt in synergistic effects of thermo-chemotherapy on human small cell lung cancer H446 cell apoptosis［J］. Chin J Cancer， 2010， 29（4）: 391-395.

［6］ Vivanco I， Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer［J］. Nat Rev Cancer， 2002， 2: 489-501.

［7］ West KA， Castillo SS， Dennis PA. Activation of the PI3K/Akt pathway and chemotherapeutic resistance［J］. Drug Resist Updat， 2002， 5: 234-48.

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Effects of casticin on the sphere-forming capability and p-Akt expression in stem like cells from H466 cell line

Yi Heng-zhong1， Long Ling-zhi2， Zhou Yuan2， Cao Jian-guo2， Chen Rong2
（1. The Chest Disease Hospital of Hunan Province， Changsha 410013， China；2. Department of Pharmaceutical Science， MedicAL College， Hunan Normal University， Changsha 410013， China）

Objective To investigate the effect that casticin（CAS） inhibits the sphere-forming capability in stem-like cells form human small cell lung cancer H446 cell line and to explore whether the mechanism is involved in down-regulation of p-Akt expression. Methods The secondary passage sphere-forming cells of H466 cell line were obtain using sphere-forming assay，and then the effects of CAS or LY294002 or in combination on sphere-forming rate were detected. The expression of p-Akt and Akt was analyzed by Western blot. Results CAS decreased sphere-forming rate and p-Akt expression， in a concentration-dependent manner. LY294002 （5.0μmol/L） enhanced inhibitory effect of CAS on sphere-forming capability and down-regulation of p-Akt expression. Conclusion CAS could suppress the sphere-forming capability of stem-like cells derived from H466 cell line. And LY294002， the specific inhibitor of Akt， effectively enhance the effect that CAS inhibits the sphere-forming capability and p-Akt expression in the lung cancer stem like cells.

casticin， small cell lung cancer， lung cancer stem-like cells， self-renewal， p-AKt

R734.2

A

1673-016X（2015）03-0003-04

2015-03-20

湖南省中医药管理局科技计划项目（No. 201269）

陈蓉，E-Mail: hncschenrong@163.com