石蜡标本DNA提取优化方案

李一平，周 磊，曹佳实，张培培，孙 妮，朱昊月，张 冉

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410013；2.长沙血液中心，长沙 410001）

石蜡标本DNA提取优化方案

李一平1，周 磊1，曹佳实1，张培培1，孙 妮2，朱昊月1，张 冉1

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410013；2.长沙血液中心，长沙 410001）

目的：探索从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取出高纯度、高浓度DNA的优化方案，为临床DNA的常规检测提供快速、经济、实用的方法。方法：选取2011年～2013年间于湖南省某大型医院收集的598例卵巢组织石蜡标本进行切片、脱蜡、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳及分析。结果：提取的DNA中，69.4%的纯度能达到标准值，99%以上标本能扩增出内参。结论：选择适合的切片厚度，脱蜡时间和方法，合理的消化酶浓度及时间，试剂的选取等均可改善提取DNA的质量。

DNA提取；福尔马林固定石蜡包埋组织；优化方案

福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin fixed and paraffin embedded tissues，FFPET）在档案性材料中占有很大比例，是临床病理诊断中使用最广、最易获得的标本，从中提取DNA一方面解决了病例来源少的困难，另一方面常被用于大宗病例的回顾性研究［1］。福尔马林作为生物标本的保存液具有渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快等优点，但甲醛同时会引起蛋白、DNA等大分子之间相互交联，当溶液pH值低于1时，DNA会在无缓冲液时直接降解成小片段。传统的酚氯仿抽提法是最早从石蜡包埋组织中纯化DNA的方法，虽然满足PCR等分析要求，但其所用试剂毒性强、操作步骤复杂、样品损失量大、交叉污染也随之增多。因此从FFPET中提取DNA以及应用DNA进行基因研究中存在检测成功率极低、重复性差等问题，多数文献描述提取DNA方法成功率为60%～80%［2］。获得足够纯度和数量的DNA是各种基因分析方法的先决条件，因而寻求一种污染相对较小且有效的方法，对于相关研究的开展无疑具有重大意义，本实验在结合以往经验及参考相关文献的基础上，通过改变离心时间和速率，优化试验参数，成功从石蜡标本中提取出相对较高质量高浓度的组织DNA。

1　资料与方法

1.1标本来源 598例石蜡包埋标本取自湖南省某大型医院病理科2011年～2013年6月间在该医院住院时手术取出组织并存档的蜡块。根据存档的H&E染色切片，选择相应石蜡块进行组织完整连续切片。所有标本均经10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋。所有标本均保存完整，常规切片，HE染色，镜下观察无组织自溶、坏死、大片出血等。

1.2主要步骤

1.2.1脱蜡 ①分别设置水浴槽或加热块温度为37℃和50℃；。②放置表面积20～50 mm2厚度5～15μm组织块1～8节（15～20 mg组织）至无菌的1.5 mL微量离心管；③样本中加1.0 mL 二甲苯，置40℃恒温水浴中，第一次脱蜡2 h后以16000×g离心4 min，小心去除上清液，再向微量中加入1.0 mL 二甲苯，第二次脱蜡12 h后以16000×g离心4 min，小心去除上清液；④向微量离心管中，加入无水乙醇1.0 mL，并在室温下孵育3 min；⑤在室温以16000×g 离心颗粒状组织4 min。小心去除上清液；⑥用95%乙醇萃取一次，其余步骤重复第4和第5点；⑦向微量离心管中加入75%乙醇1.0 mL，置75℃水浴中20 min 后，以16000×g离心4 min，小心去除上清液后将其放入37℃恒温箱干燥15～20 min，至样品烘干为止。

1.2.2DNA提取 按照PureLinkTM Genomic DNA Mini Kit 试剂盒（美国invitrogen公司）说明书进行DNA提取。

1.2.3DNA纯度测定 将提取的DNA取出2μL与198μL无菌的超纯水混匀于比色杯中，先用超纯水校正零点，核酸蛋白测定仪（BioPhotometer Plus型，德国eppendorf公司）分别测A260nm和A280nm的吸光度值。当A260/A280为1.8±0.1时，说明提取的总DNA纯度合格。

1.2.4内参引物扩增

表1　人β-珠蛋白引物序列及扩增产物片段

内参引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，其PCR扩增条件：

95℃预变性5 min，然后95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，重复40个循环，最后72℃延伸5 min。

2　结果

2.1DNA纯度测定结果 提取组织DNA后测A260nm和A280nm的吸光度值，当A260/A280为1.8± 0.1时，说明提取的总DNA纯度合格。经统计比值范围在1.8±0.1的样本数为415例，占总数的69.4%；比值范围在1.60～1.70的样本数为52例，占总数的8.7%；比值范围在1.90～2.00的样本数为44例，占总数的7.9%。

2.2内参条带扩增结果 99%以上样本均可扩增出内参条带。经2%琼脂糖电泳后可见清晰的内参条带，如图1所示。

图1　石蜡标本提取DNA内参引物扩增结果

3　讨论

卵巢位于子宫底的后外侧，与盆腔侧壁相接，属于腹膜内位器官，所以研究者通常难以在短期内获得大量病理新鲜标本，要获得大批量新鲜标本往往是需要花费几年的时间，这些困难致使卵巢癌发病研究进程受到阻碍［3］。医院病理科档案中积存的大量FFPET，是一个可利用的研究材料来源。FFPET中不含或少含PCR抑制物，即使不经过大量繁复提取步骤获得的简单粗提物也能用于PCR。但是甲醛作为生物标本的保存液却会对DNA分子产生不利影响，表现为DNA分子呈现可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，同时DNA与蛋白质之间经广泛交联后往往会形成牢固的复合物，存在于组织中的DNA易于在甲醛固定和石蜡包埋过程中出现脆性增加、与蛋白质交联等损坏，从而影响FFPET的DNA提取，经过甲醛固定超过5天的组织，DNA一般都会出现降解，提取结果经常是DNA片段短、产物少、抑制物多，需要扩增质量DNA的PCR受上述因素影响不能进行后续研究。因此DNA的优化提取技术显得尤为关键，本研究在前人已有实验基础上对常规提取方法进行优化，应用于598例卵巢上皮癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）及正常和交界对照病例的回顾性研究。

对于基因分析而言，要想获得更加准确的检测结果，就必须获得足够数量和纯度的DNA来满足要求进行分析。在操作过程中，我们认为以下几点对DNA提取质量至关重要。⑴ 切片厚度：通过福尔马林固定和石蜡包埋的组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。以往的做法是将组织切成3-5 um薄片，使每一细胞都被切开。但是，有研究认为切片太薄，容易过多地将DNA切断，影响高分子量DNA的获取率，最好是采用15～20um左右的厚切片。本实验中采用的切片厚度为5～15 um，介于二者之间，DNA的获取量以及质量均达到更为理想的要求。⑵ 脱蜡：包埋剂石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。如未能有效去除石蜡，将会形成DNA与石蜡的混合液，这非常不利于PCR扩增。现在常规使用的脱蜡方法主要有改良TES（Tris-EDTA-SDS缓冲液）水浴脱蜡和二甲苯脱蜡两种方法，还有研究将矿物油用于脱蜡和高温氢氧化钠NaOH用于提高DNA提取效率。二甲苯常用于脱蜡，本实验通过反复比对，发现使用二甲苯两次脱蜡可以使脱蜡比较彻底，并发现严格掌控脱蜡时间，将第一次脱蜡设定为2小时，第二次脱蜡设定为12小时，效果最好。脱蜡后使用100%、95%和75%的梯度乙醇脱水，可将残留的二甲苯充分去除，有利于获得较高质量的DNA。由结果可知，改进脱蜡方法可以增加DNA的浓度、纯度以及完整性。⑶ 其他因素：提取方法使用传统的苯酚-氯仿抽提法提取的DNA PCR扩增重复性差，NaCl盐析法虽然具有环保优势但操作繁复条件不易控制，同时所提取的DNA实用性差因而也不予采纳。相比之下试剂盒法所提取的DNA更有利于PCR扩增［4］，本实验采用进口试剂完成了DNA提取步骤，所获DNA纯度基本满足实验要求，99%以上样本均可扩增出内参条带。

本次实验有30.6%的标本纯度未达到标准值，除了石蜡标本本身的不足以外，可能原因之一是去二甲苯时，75℃水浴温度过高会使EP管内压力增大使盖子爆开，增加了污染的机会；可能原因之二是使用75%乙醇去二甲苯后将其放入37℃恒温箱干燥，EP管盖为打开状态，其过程有15-20 min，增加了样本被污染的机会。

本研究提供的石蜡切片的 DNA优化提取方法在2天内即可完成整个操作，并能有效用于小于500bp DNA片段的PCR扩增和杂交，为临床 DNA的常规检测提供了一种快速、 经济、 实用的方法。

［1］ 方圆， 马党， 危文素， 等. ECRG4基因在人胃腺癌组织中的表达及意义［J］. 湖南师范大学学报（医学版）， 2012， 9（1）: 69-71.

［2］ Muñoz-Cadavid C， Rudd S， Zaki SR， et al. Improving molecular detection of fungal DNA in formalin-fixed paraffin-embedded tissues comparison of five tissue DNA extraction methods using panfungal PCR［J］. J Clin Microbiol， 2010， 48（6）: 2147-53.

［3］ 阮洋， 胡月子， 陶科， 等. IL-17A及IL-17F基因多态性与卵巢上皮癌的相关研究［J］. 湖南师范大学学报（医学版） ， 2012， 9（3）: 21-23.

［4］ Burcu Sengüven， Emre Baris， Tulin Oygur， et al. Comparison of Methods for the Extraction of DNA from Formalin-Fixed， Paraffin-Embedded Archival Tissues［J］. Int J Med Sci， 2014； 11（5）: 494-499.

Study on the improvement of DNA pre-extraction from formaldehyde-fixed and paraffinembedded tissues

Li Yi-ping1， Zou Lei1， Cao Jia-shi2， Zhang Pei-pei2， Sun Ni2， Zhu Hao-yue2， Zhang Ran1
（1.Medical College， Hunan Normal University， Changsha 410013， China； 2. Changsha City Blood Center， Changsha 410001， China）

Objective The aim of this study was to explore an optimized proposal of DNA extraction from formaldehydefixed and paraffin-embedded tissues with high purity and high concentration， so as to provide a rapid， economic and practical way for DNA routine detection. Methods 598 ovarian tissue paraffin specimens collected from a large hospital of Human province between 2011 and 2013， and were cut into slices for further dewaxing， DNA extraction， PCR amplification， gel electroplate and analysis. Results Among the extracted DNA samples， 69.4% could reach the standard value in the purity and over 99% could amplify the β-action fragments by PCR successfully. Conclusion They are all helpful to better the quality of the extracted DNA that suitable slice thickness， time and of dewaxing， reasonable digestive enzyme concentration and digestion time， and the selection of reagents.

DNA extraction； formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues； optimized proposal

R361.2

A

1673-016X（2015）03-0006-04

2015-04-20

2012年湖南省大学生创新实验基金（485）；2012年湖南省财政厅专项科技项目；2013年湖南师范大学树达学院教学改革项目（00713）

张冉，E-mail:zhangran00889@aliyun.com