全自动酶免分析仪校验方法的建立

马泽芹王静刘建礼张猛韩玉田*

（1.烟台艾德康生物科技有限公司山东烟台264006；2.北京出入境检验检疫局）

全自动酶免分析仪校验方法的建立

马泽芹1王静1刘建礼2张猛1韩玉田1*

（1.烟台艾德康生物科技有限公司山东烟台264006；2.北京出入境检验检疫局）

为保证实验结果的准确性和可靠性，建立了一套全自动酶免分析仪全面校验方法，对加样系统、孵育系统、洗板系统、读数系统和全局分别采取模块式和整体式方法进行校验，从而保证各个模块的准确性和整体的可靠性。

全自动酶免分析仪；校验方法；加样系统；孵育系统；洗板系统；读数系统

1 前言

全自动酶免分析仪是运用ELISA测定的基本原理，集加样系统、孵育系统、洗板系统和读数系统为一体的综合检测系统，可以全自动完成ELISA实验，目前全自动酶免分析仪越来越多地应用于各大医院、血站、计生站和科研单位，它能有效减轻操作人员的劳动强度，并提高检验的准确性和可靠性。但不当的操作和维护以及长时间使用可能造成实验结果的较大偏差，因此定期进行全自动酶免分析仪的校验非常必要［1，2］。以下介绍全自动酶免分析仪校验方法的建立。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1加样系统

万分之一天平：用于测定加样纯水的质量；带板条的干净酶标板：用于盛放加样时的纯水；干净密封性容器：用于盛装纯化水；无粉手套：实验过程中需要全程戴手套，以防手上的汗渍、灰尘等对实验结果的影响。

2.1.2孵育系统

PT1000的温度计：测量孵育系统的温度变化，需要经过国家质检部门的校验，并提供校验报告。

2.1.3洗板系统

万分之一天平：用于测定洗板前酶标板的质量和洗板后酶标板的质量；带板条的干净酶标板：用于全自动酶免分析仪进行洗板过程；无粉手套：实验过程中需要全程戴手套，以防手上的汗渍、灰尘等对称量结果的影响。

2.1.4读数系统

标准比色片组：吸光度分别为0.2A、0.5A、1.0A、1.5A，不确定度≤0.01；比色片证书编号：01268-15-0；厂家编号：MB1-043。

2.1.5整体性能

酶标板：5块，乙肝每个项目一块微孔板；试管：96个，放置实验过程中使用的校准品和血清；蒸馏水：在实验过程中代替校准品、血清、酶等试剂和洗涤液。

2.2方法

2.2.1加样系统校验

全自动酶免分析仪的加样系统需要定期的校验，以确保加样量和测定结果的准确性。加样系统校验采用称量法，此方法操作简单，也适用于对全自动加样系统的日常校正［3］。

2.2.1.1加样量的精密度

使用纯水，每次使用对应的加样头加样，加样量100 μL，密封性容器。在实验模式选择中，称量容器质量，加注纯水后用精密天平称重，求算加样纯水的质量，重复实验6次，计算6次加样量的变异系数（CV值，%）。为了试验结果的准确性，每个加样通道均进行校验。

2.2.1.2加样量的准确性

使用纯水，每次选择对应的加样头加样，加样量100 μL，密封性容器。在实验模式选择中，称量容器质量，加注纯水后用精密天平测量，求算加样纯水的质量，重复实验6次，计算6次加样量的平均值，换算为测定时对应温度下纯水的体积，计算测试平均值与相对误差。为了试验结果的准确性，每个加样通道均进行校验。

2.2.1.3加样系统精密度

利用全自动酶免分析仪的加样系统，加100 μL柠檬黄溶液至96孔酶标板内。此柠檬黄液体需要按特定的比例配制，要求配置的液体用酶标仪测试时的读数在1.0-1.5之间。加样系统自动分液100 μL/孔后，使用酶标仪双波长测量加样后酶标板的OD值，记录并分析加样96孔酶标板的精密性。

2.2.2孵育系统校验

利用全自动酶免分析仪的控制软件，开启孵育器的温度，温度设定在待测温度。将PT1000温度计贴在孵育器上面，待温度相对稳定在待测温度后，分别记录孵育器5个点（周围4点和中间的1点）的温度测定值。在1 h内连续测定5次并记录，取平均值与标示值之差（即偏差），最大值与最小值之差的一半为波动性。全自动酶免分析仪的孵育系统是独立的控温孵育器组成，所以每个独立的孵育模块均要进行温度的校验。

2.2.3洗板系统校验

取96孔酶标板称重并记录酶标板质量，全自动酶免分析仪利用软件控制对酶标板用蒸馏水进行板式洗涤1次后再称重并记录酶标板的质量，将洗涤后酶标板的质量减去洗涤前酶标板的质量，然后换算成体积单位，除以96为每孔残液量，洗板机的校准标准为每孔≤2 μL［4］。

2.2.4读数系统校验

读数系统的校验是依据标准《酶标分析仪检定规程》（JJG861-2007）进行［5］。在校验酶标仪时，需先将酶标仪预热30 min。

2.2.4.1示值稳定性（漂移）

选用450 nm、630 nm，标称1.0的标准滤光片放置到空微板架，以空气做参比读数，测量并记下仪器初始值，5 min后记录仪器示值，10 min后再次记录仪器示值，求出两次吸光度示值的最大值，按照公式（1）计算示值稳定性。示值稳定性的校验标准≤±0.005。

式中：Ai-第i次测量的吸光度值；

A初始-仪器的初始值。

2.2.4.2吸光度示值误差（准确度）

选用450 nm、630 nm中性滤光片放到空微板架上，以空气做参比连续读3次。依次记录仪器示值，并计算平均值。示值误差ΔA按照公式（2）进行计算：

式中：Ai-第i次测量的吸光度值；

As-吸光度的标准值。

仪器吸光度示值误差结果的报告以450 nm、630 nm下，通过测量计算得到的吸光度示值误差的最大值得出。吸光度示值误差的校验标准为≤±0.03。

2.2.4.3吸光度重复性的测量

选用450 nm、630 nm波长，将吸光度标称值为0.5或者1.0的光谱中性滤光片放到空微板架上，以空气为参比，于固定的某一孔位测量6次，记录仪器示值，并计算平均值，按照公式（3）计算RSD值，以实验结果的相对标准偏差值（RSD值）表示仪器吸光度值的重复性。RSD的校验标准为≤1%。

其中：xi-第i次测量的结果；

x¯-n次测量结果的吸光度平均值；

n-测量的次数。

2.2.4.4通道差异的测定

选用450 nm、630 nm波长，将吸光度为1.0的光谱中性滤光片放在空的酶标板架上，先后置于每个通道相应的位置上，以空气作为参比，测量并记录每个通道至少6次的吸光度值。多个通道的差异结果报告用全部测量数据的极差表示按照公式（4）计算通道差异δA。

式中：Amax-多个通道测量结果的吸光度最大值；

Amin-多个通道测量结果的吸光度最小值；

δA-通道差异。

2.2.5整体性能

全自动酶免分析仪的整体性能通过用水模拟实验过程的方式进行校验。以乙肝五项的实验方法进行整体性能的校验，在全自动酶免分析仪软件上编辑乙肝五项的实验方法，准备实验用一次性加样头、校准品和血清（用蒸馏水代替）、酶等试剂和洗涤液（用蒸馏水代替）、酶标板。然后利用全自动酶免分析仪同时运行乙肝五项的实验方法。其中实验过程中的孵育时间可以设置成5 min。

3 结果

3.1加样系统

3.1.1加样量的精密度

结果见表1。测试4个加样通道的加样量，其加样量的变异系数分别为0.5%、0.6%、0.6%、0.5%。

3.1.2加样量的准确性

结果见表1。通道1测试6次平均值与100 μL之间的差异为1.1 μL，其他3个通道的差异为0.5 μL、1.0 μL、1.0 μL。

表1　加样量精密度和准确性

3.1.3加样系统精密度

结果见表2。利用4通道加样系统进行分液，测试整板的OD值，其CV为1.3%，加样的误差完全符合实验的要求。

表2　加样系统精密度

3.2孵育系统

表3为一个独立孵育模块的测试结果。

表3　孵育模块温度测试数据（单位℃）

从实验数据上看，孵育模块的温度偏差（平均值与标示值之差）为37.172-37=0.172℃；波动性（最大值与最小值之差）为37.7-36.4=1.3℃。

3.3洗板系统

洗涤前酶标板的质量为24.534 g，洗涤后为24.378 g，洗涤前后质量差为0.156 g，换算成体积为156 μL。因每酶标板上有96孔，所以每孔的残液量为156 μL/96=1.625 μL。

3.4读数系统

3.4.1示值稳定性

表4为示值稳定性的试验结果。

表4　示值稳定性

r=1.0045-1.002=0.0025，符合标准要求（≤±0.005）。

3.4.2吸光度示值误差

表5为吸光度示值误差的试验结果。

表5　吸光度示值误差

结果显示，吸光度示值误差符合标准要求（≤± 0.03）。

3.4.3吸光度重复性

表6为吸光度重复性的测量结果。

表6　吸光度重复性

结果显示，吸光度重复性符合标准要求（RSD≤1%）。

3.4.4通道差异的测定通道差异的测定结果见表7。

表7　通道差异

3.5整体性能

此整体性能的测试，主要检测全自动酶免分析仪各个模块的运行情况，在检测过程中要达到各模块之间配合协调，运行流畅。此项目的检测并不产生具体的数据结果。

4 讨论

4.1环境对加样精度的影响

全自动酶免分析仪在使用和校验时，对环境的温度有特殊的要求。实验室环境温度的变化对加样系统的加样精度有很大的影响，可能导致加样精度的不准确，产生系统误差甚至造成弱阳性样本的漏检［6］。所以在对全自动酶免分析仪进行使用和校验时，要保证实验室的温度恒定并根据不同仪器的使用环境对实验室的环境进行设置。

4.2洗板机的维护

几乎所有试剂盒中的洗液都是需要经过稀释才可以使用，虽然洗液的浓度比较低，但是这些洗液在洗板机和管路中存留的时间过久之后，还是会有结晶产生。结晶的时间过久会不容易清理。而当洗板机和管路中有结晶存在时，测量出的每孔残留量是不准确的，所以全自动酶免分析仪在使用之后，需要用蒸馏水对洗板机和管路进行冲洗，以防洗板机和管路中产生结晶，从而对实验结果产生影响。

4.3读数仪的校验

在全自动酶免分析仪中，读数仪是一个单独的模块，可以单独进行校验。有些大的实验室和医院已经形成了一套成熟的对读数仪进行校验的方法，在此情况下，读数仪的校验方法和流程可以按照实验室的校验方法进行。

5 结论

全自动酶免分析仪是集加样系统、孵育系统、洗板系统和读数系统为一体的综合检测系统，其校验是一个复杂的过程，必须针对机器的特性，采用模块式和整体式相结合的方式对其进行科学、全面校验，这样才能保证临床实验过程中所得数据的重复性和准确性。

［1］栾燕，沈光，刘显智.血站仪器设备管理浅析［J］.中国输血杂志，2009，22（1）：17-18.

［2］李明生.血站仪器设备检定和校准的思索与体会［J］.临床输血与检验，2005，7（4）：299-300.

［3］杨青成，郑康林，宋冬云.对全自动加样系统校正的探讨［J］.中国输血杂志，2004，17（3）：164-165.

［4］张岳，李竹青.自动洗板机校准方法的研究［J］.中国计量，2013，4：102-103.

［5］JJG861-2007酶标分析仪检定规程［S］.

［6］费荣，张立波，马贵明.环境温度变化对全自动加样器影响分析［J］.临床血液学杂志，2013，26（6）：410-411.

Envisage of Calibration Methods of Fully Automated ELISA Analyzer

Ma Zeqin1，Wang Jing1，Liu Jianli2，Zhang Meng1，Han Yutian1*
（1.Yantai Addcare Bio-Tech Limited Company，Yantai，Shandong，264006；2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

To ensure the accuracy and reliability of experimental results，an overall calibration method of Fully Automated Elisa Analyzer is established.Modular and unitary verification of pipetting system，incubation system，washing system，reading system and the whole system ensures the accuracy and reliability of each modles and overall performance respectively.

Fully Automated Elisa Analyzer；Test Method；Pipetting System；Incubation System；Washing System；Reading System

R446.61

E-mail：mazeqin@addcare.cn；*通讯作者E-mail：hanyutian@addcare.cn

国家质检总局科技计划项目（2013IK306）

2015-06-09