ELISA检测试剂盒在出入境检验检疫中的应用与质控

魏海燕 曾静 张伟 刘建礼 梁新苗 李东燕 刘来福

（北京出入境检验检疫局 北京 100026）

ELISA检测试剂盒在出入境检验检疫中的应用与质控

魏海燕 曾静 张伟 刘建礼 梁新苗 李东燕 刘来福*

（北京出入境检验检疫局 北京 100026）

介绍了ELISA检测试剂盒在检验检疫中的应用情况、面临的问题及当前的监管现状，并探讨了ELISA检测试剂盒的质控评价方法。

ELISA；试剂盒；检验检疫；应用；质控

1 前言

自从Engvall和Perlmann（1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验［1］（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）以来，随着方法的不断改进、材料的不断更新，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用，尤其是商品化ELISA检测试剂盒的问世，进一步推动了检测领域自动化、标准化和高通量的发展进程，使其广泛应用于医疗、食品安全检测、出入境检疫、环境监控等领域。

2 ELISA检测试剂盒在我国出入境检验检疫领域中的应用概况

目前ELISA检测试剂盒在我国出入境检验检疫中的应用范围覆盖食品安全检测、动物检疫、植物检疫和卫生检疫等领域。如食品安全检测领域针对食品中的过敏原、维生素、转基因成分、农药残留、兽药残留、生物毒素、致病微生物检测的ELISA试剂盒；动物检疫方面猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的ELISA检测试剂盒；植物检疫中针对植物病毒、细菌、真菌、植物激素进行检测的ELISA试剂盒；卫生检疫中细胞因子检测试剂盒、内分泌检测试剂盒、自身免疫检测试剂盒、传染病检测试剂盒、特种蛋白检测试剂盒、肿瘤标志物检测试剂盒等。可见，ELISA检测试剂盒已成为国境检验检疫安全侦检技术体系中的重要组成，是有害生物及有毒有害物质检测不可或缺的重要技术手段，极其适合出入境检验检疫对大量样品快速筛查的需求。据不完全统计，我国出入境检验检疫中应用的ELISA检测试剂盒多达200余种，尤其在动物检疫领域中的应用最为广泛。

出入境检验检疫领域所涉及的ELISA试剂盒根据其所用的固相载体可区分为3大类型：①采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA试剂盒，即通常所指的微量板ELISA试剂盒，也是目前应用最多的一种；②用硝酸纤维膜为载体的ELISA试剂盒，又称斑点ELISA试剂盒；③采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA试剂盒，称为布ELISA试剂盒。在微量板ELISA试剂盒中，又根据其性质不同分为间接ELISA试剂盒、双抗体夹心ELISA试剂盒、双夹心ELISA试剂盒、竞争ELISA试剂盒、阻断ELISA试剂盒及抗体捕捉ELISA试剂盒等。此外，商品化ELISA检测试剂盒还可分为定性检测用与定量检测用两种，前者试验出具的检测报告仅出具阴性与阳性的判断结果，不报送具体检测数值，后者试验出具的检测报告报送在检测限以上的检测数值，当前检验检疫中所使用的ELISA检测试剂盒主要是定性检测。

通过调研发现，当前出入境检验检疫领域所使用的ELISA检测试剂盒多依赖于进口产品，其生产商多是发达国家的一些大型老牌生物或制药公司，如法国生物梅里埃、美国AGDIA公司、德国拜发公司等。这些进口试剂盒价格昂贵，一个96孔ELISA检测试剂盒通常需要5 000-6 000元，较高的检测成本限制了检测工作的开展和检测技术的推广；此外，试剂盒进口周期一般较长，难以应对紧急突发事件；某些试剂盒进口渠道有限，甚至无法进口，导致某些检测项目只有送到国外才能确认。尽管如此，这些试剂盒在检测人员尤其是官方实验室和第三方检测机构中的认同率仍然非常高。分析其原因主要是由于其可靠的质量保障，这些产品在入市前大都经过了一些官方或权威机构的认证，如AOAC、AFNOR等。与之相比，国内ELISA检测产品，大都未经过相关组织认证，产品关键性能指标和稳定性缺乏有效的数据支撑，市场占有率较低。

3国产ELISA检测试剂盒在应用中面临的问题

近年来国产ELISA检测试剂盒得到了飞速发展，应用范围日趋广泛，产业化规模不断扩大，在某些领域甚至具有不可替代性，但同时也出现了一些不可忽视的隐患。首先，ELISA试剂盒的研发与生产成本较低，投入产出值较高，研发周期相对较短，一些水平低、规模小、管理差的企业也纷纷加入生产行列，市场上的产品质量良莠不齐。其次，对ELISA检测试剂盒缺乏完备的质量控制和质量保证体系，绝大多数的ELISA检测试剂盒处于监管缺失状态，产品市场准入门槛低，一些低劣的ELISA检测试剂盒甚至未经方法学评价就涌入市场，对检测结果的准确性带来了巨大隐患。此外，ELISA检测试剂盒涉及抗体等生物活性分子，抗体效价高低、特异性强弱，稳定性好坏都将直接影响检测结果。可见，ELISA试剂盒的质量把关是保障检测结果的可靠性、可比性和权威性的重要前提，尤其对于“凭技术执法、靠数据说话”的检验检疫工作而言更是有着举足轻重的作用。选用可靠的ELISA检测试剂盒有助于提高我国检验检疫实验室的竞争力，提升政府信任度，促进检测结果的国际互认，冲破国外技术壁垒，树立我国的地位和形象，推动进出口贸易的发展。

国内近几年开始重视针对试剂盒的管理工作，如农业部对兽药残留酶联免疫检测试剂盒进行备案管理［2，3］，国家食品药品监督管理局对体外诊断试剂实行分类注册管理［4，5］，国家质量监督检验检疫总局则发布了出入境检验检疫行业标准《商品化食品检测试剂盒评价方法》（SN/T 2775-2011），对商品化食品安全检测试剂盒市场准入及管理方面作出了规定［6］。虽然三个部门对不同领域试剂盒的监管均有涉及ELISA检测产品，但尚未能建立成熟的专门针对ELISA检测试剂盒的监管体系，在许多领域仍存在监管空白。

4 ELISA检测试剂盒的质量控制

ELISA检测试剂盒的质量控制在其生产和应用中都具有重要的意义，便于ELISA检测试剂盒生产企业及用户在生产或使用时对相关技术指标进行评价，维护产品质量，了解使用该试剂盒对检测结果的影响，保障检测结果的可靠性。目前，国内对ELISA检测试剂评价方面的研究多涉及医学领域，使用的方法也不尽相同［7］。而国外一些知名的国际组织或学会自20世纪80年代以来纷纷建立了较为完整的针对商品化试剂盒的评价程序，更为注重对于采用试剂盒进行检测时可以满足的方法学指标进行确认，其中较为有名的如国际标准化组织（ISO）和美国分析化学家协会（AOAC）的评价方法［8，9］。ELISA试剂盒种类繁多，技术原理多样，在实际的验证工作中可根据产品特点、应用范围、针对的目标物和适用的检测基体，综合参考ISO、AOAC的相关标准和规范，从保证检测结果的准确性入手，从检测技术性能指标对ELISA试剂盒进行评价。例如，以食品中致病微生物的ELISA检测试剂盒为例，可从以下几个指标进行验证。

4.1相对精确度、相对灵敏度、相对特异性

根据ELISA试剂盒的适用范围和用户自身的要求选择需验证的食品种类，食品样品的来源要尽可能广，包括不同地域，避免地域上的偏差。如选用自然污染的样品要尽可能代表该类食品通常的污染水平，尤其是污染范围的低限；如果无法获得足够数量的自然污染样品，也可使用人工污染的食品样品，这种样品污染水平应与ELISA试剂盒提供的临界控制值一致，以保证对于同一种样本能有部分阳性，部分阴性的结果。每种代表性食品的测试样品数应达20以上，以满足统计学计算要求；采用ELISA试剂盒方法和参考方法进行同步检测，按下表进行计算。

表1　ELISA试剂盒方法和参考方法的检测结果表示［8］

注：N是所有样品数的总和（NA+PA+PD+ND）；N-是参考方法获得的阴性结果数（NA+PD）；N+是参考方法获得的阳性结果数（PA+ND）。

4.2相对检测水平、与参考方法的一致性

根据ELISA试剂盒的验证要求，选取合适的验证菌株和食品种类，尽可能使每种菌伴随一种食品类别。针对每种食品中的一个目标菌至少检测其3个水平：第1个水平可以是阴性对照，第2个水平应是理论上的检测限，第3个水平稍高于理论检测阈值。利用ELISA试剂盒方法和参考方法对每种组合（食品类型、污染水平）都重复检测至少6次。

对每个水平和每种食物/菌株组合，可按表2所示采用Fisher精确检验进行比较。

不仅可比较ELISA试剂盒方法同参考方法用于同一食品/菌株中同一接种水平检测时有无差异，而且可比较相同接种水平的两种不同食品/菌株组合的检测结果。相对检测水平则可用检出率刚好超过50%时所对应的样品污染水平来表示。

表2　相对检测水平的计算［8］

4.3包容性和排他性

根据ELISA试剂盒的测定范围选择合适的目标菌50株，另从可能对目标菌检测造成干扰和所验证食品中出现概率高的菌株中选择非目标菌至少30株。目标菌的检测水平要比ELISA试剂盒的相对检测水平高10至100倍，非目标菌的检测水平应与所验证食品中可能出现的最高污染水平相当。利用ELISA试剂盒和参考方法对上述菌株的纯培养物进行同步检测，比较ELISA试剂盒的包容性和排他性。

除了上述主要指标，对定量检测用ELISA试剂盒还应评价其检测范围、检测限、定量限、回收率等指标，具体计算亦可参考ISO或其他官方验证方法［6，8］。同时，在试验设计上同样应注重对试验样本的选择，细致地划分检测样本的类型，从而使得对ELISA试剂盒的评价更具科学性。

5 结语

ELISA试剂盒在我国出入境检验检疫领域中有着广阔的应用前景，其质量把关是保障检测结果的可靠性、可比性和权威性的重要前提，尤其对于“凭技术执法、靠数据说话”的检验检疫工作而言更是有着举足轻重的作用。建立科学规范的ELISA检测试剂盒评价体系，加强使用过程中的质量控制，可有助于提高我国检验检疫实验室的竞争力，提升政府信任度，促进检测结果的国际互认，冲破国外技术壁垒，树立我国的地位和形象，推动进出口贸易的发展。

［1］Engvall E，Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.Quantitative assay of immunoglobulin G Immunochemistry，1971，8（9）：871-874.

［2］农业部.关于加强兽药残留检测试剂（盒）管理的通知［Z］.农办医［2005］3号，2005.

［3］农业部.关于发布《兽药残留酶联免疫试剂（盒）备案审查技术资料要求》和《兽药残留酶联免疫试剂（盒）备案参考评判标准》的通知［Z］.农医发［2005］17号，2005.

［4］国家食品药品监督管理局.关于印发体外诊断试剂注册管理办法（试行）的通知［Z］.国食药监械［2007］229号，2007.

［5］国家食品药品监督管理总局.体外诊断试剂注册管理办法［Z］.国家食品药品监督管理总局令第5号，2014.

［6］SN/T 2775-2011商品化食品检测试剂盒评价方法［S］.

［7］毕胜利.ELISA检测试剂的评价方法［D］.北京：中国协和医科大学，2006.

［8］ISO 16140：2003（E）Microbiology of food and animal feeding stuffs-Protocol for the validation of alternative methods［S］.

［9］Appendix M：Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods：Community Guidance and Best Practices.Official Methods of Analysis，19th Ed.，2012，AOAC INTERNATIONAL，Gaithersburg，MD.

Application and Quality Control of ELISA Detection Kit in Entry-Exit Inspection and Quarantine

Wei Haiyan，Zeng Jing，Zhang Wei，Liu Jianli，Liang Xinmiao，Li Dongyan，Liu Laifu*
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026）

This paper introduced the application of ELISA test kit in inspection and quarantine field，the existing problems and the present situation of supervision，and discussed the evaluation method of quality control for ELISA kit.

ELISA；Kit；Inspection and Quarantine；Application；Quality Control

R446.61

E-mail：weihy@bjciq.gov.cn；*通讯作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

国家质检总局科技计划项目（2013IK306）

2015-06-09