ELISA快速测定牛奶中阿维菌素前处理方法的建立

刘萤吴小平苏丽芳王文珺陈银辉

（1.北京出入境检验检疫局 北京 100026；2.北京维德维康生物技术有限公司）

ELISA快速测定牛奶中阿维菌素前处理方法的建立

刘萤1吴小平2*苏丽芳2王文珺2陈银辉2

（1.北京出入境检验检疫局 北京 100026；2.北京维德维康生物技术有限公司）

改进ELISA快速测定牛奶中阿维菌素的前处理方法，以改进后处理液作为标准品基质绘制标准曲线，IC50浓度值为1.9 μg/L，与PBS缓冲液测定值相同；对牛奶中阿维菌素的检出限为2.0 μg/L，对牛奶样品的加标回收率范围为75.8%-104.8%，批内、批间变异系数均未超过15.0%；以两种前处理方法对实际样品进行处理后检测，改进后处理方法检测结果更接近仪器方法检测值且与检测值相差不大，因此该试剂盒可满足相关残留检测国家标准，能满足我国市场和进出口食品检测需要。

阿维菌素；前处理；试剂盒；牛奶

1 前言

阿维菌素（Avermectins，）是由链霉素产生的十六元大环内酯化合物，对线虫和节肢动物有极强的驱杀作用，是目前兽医临床上用量最大的抗寄生虫药［1，2］，50%以上的抗寄生虫药为该类药物。阿维菌素的显著特点是：药效持久，难以确定休药期，在动物体内残留的时间比较长。按WHO五级分类标准，阿维菌素类仍属高毒化合物［3］。美国、欧盟、食品法典委员会（CAC）和中国等均制定了阿维菌素类药物的残留限量，CAC和许多国家对该类化合物的残留限量为10 μg/kg［4］，2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所用牛肌肉和奶中残留限量也是10 μg/kg［5］。

目前阿维菌素试剂盒前处理方法存在基质影响大，检测限偏高，回收率较低的问题［6］。为提高试剂盒的性能，本研究改进了阿维菌素的前处理方法，以期提高阿维菌素试剂盒的性能，使试剂盒能够更准确的用于牛奶中阿维菌素残留的快速测定。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1试验样品

牛奶为市售产品。

2.1.2试剂

乙腈（分析纯）、正己烷（分析纯）、甲醇（分析纯）等生化试剂：上海华美公司；阿维菌素酶联免疫试剂盒：北京维德维康生物技术有限公司。

2.1.3仪器

酶标仪MK3、微量移液器：美国Thermo公司；生化培养箱：天津中环实验电炉有限公司；漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；氮吹仪：美国Organomation；低速离心机：上海安亭科学厂。

2.2方法

2.2.1PBS缓冲液配制

1 000 mL去离子水加入NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4·12H2O 5.8 g，KH2PO40.4 g。

2.2.2改进前样品处理方法

取3mL牛奶于50mL离心管中，依次加入9 mL乙腈、3 mL正己烷，充分涡动1 min；15℃，4 000 r/min离心10 min；吸取下层1 mL于离心管中，60℃水浴中氮气吹干；加入1 mL样品稀释液（PBS缓冲液），充分涡动1 min，取50 μL进行检测。

2.2.3改进后样品处理方法

取1 mL牛奶于10 mL离心管中，加入3 mL甲醇，高速涡动1 min；25℃，4 000 r/min离心10 min；取1mL上清于4mL离心管中，50℃水浴中氮气吹干；加入0.5 mL含25%甲醇的缓冲液，充分涡动1 min；取50 μL进行检测。

2.2.4前处理方法效果验证

分别对两种前处理方法进行基质效应、检测限、准确度、精密度以及实际样品检测符合率进行验证。

3 结果

3.1基质效应测试

分别检测PBS缓冲液、两种样品处理方法的处理液对绘制标准曲线的影响。将阿维菌素标准品分别溶于3种基质溶液中，配制成浓度为0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L标准液，按照试剂盒的操作方法测定，绘制曲线进行分析。PBS缓冲液、改进前牛奶处理液和改进后牛奶处理液3种基质溶液所测定标准曲线的IC50分别为1.9 μg/L、2.3 μg/L和1.9 μg/L，结果见图1。

图1　不同基质溶液对试剂盒标准曲线影响

结果显示，PBS缓冲液与改进后牛奶处理液各浓度标准品OD值、IC50差异不大，而与改进前牛奶处理液差距相对较大，因此，改进后方法更适用于牛奶样品的前处理。

3.2试剂盒检出限比较

用ELISA试剂盒分别检测20份以两种前处理方法处理的阴性牛奶样品，计算样品中阿维菌素的浓度。检出限等于阴性样品检测浓度的平均值加上阴性样品检测浓度的3倍标准差，即：

检出限=x+3s

式中：x为20份阴性样品浓度平均值，s为20份阴性样品的标准差。

测定结果见表1。改进前处理方法检测牛奶中阿维菌素的检出限计算值为2.7 μg/L，改进后处理方法检测牛奶中阿维菌素的检出限计算值为1.7 μg/L。考虑到实际检测中操作方面的误差，改进前和改进后试剂盒的检出限分别确定为3.0 μg/L和2.0 μg/L。

表1　检出限测定结果

3.3准确度和精密度测试

准确度和精密度分别以回收率和变异系数（CV）表示。在阴性牛奶中添加不同浓度的阿维菌素标准品，每个浓度添加5份，按照改进后处理方法检测牛奶样本，计算样品回收率和变异系数，以评价试剂盒的准确度和精密度，结果见表2。

表2　准确度和精密度测定结果

结果显示，回收率范围在75.8%-104.8%之间，批内变异系数≤12.7%，批间变异系数≤14.2%，均未超过15%，表明阿维菌素试剂盒具有较高的准确度和精密度。

3.4实际样品检测结果

用ELISA试剂盒分别检测10份以2种前处理方法处理的牛奶样品，计算样品中阿维菌素的浓度。对于检测浓度≥5 μg/L的样品用LC-MS/MS方法进行确证，考察前处理方法的可靠性。LC-MS/MS方法参照GBT 22968-2008《牛奶和奶粉中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行。检测结果见表3。

表3　ELISA法检测实际样品结果

结果显示，与改进前处理方法相比，改进后处理方法处理后的牛奶样品检测值普遍偏大；与仪器方法相比，改进前处理方法的检测结果偏离较大，因此改进后处理方法的检测结果具有较高可信度，更适合用于牛奶中阿维菌素残留的检测。

4 讨论

（1）基质效应性可能抑制免疫结合反应，使竞争效率下降，表现为曲线异常，斜率减小，IC50增大，灵敏度下降，如果基质干扰严重，则需要对样品前处理增加净化步骤或者对处理液进行适当稀释。本研究对牛奶中阿维菌素检测方法进行了探索，改进了前处理方法，减少了基质效应性，增加了试剂盒检测可信度。

（2）ELISA试剂盒灵敏度高，重复性好，检测时间短，样品前处理简单，仪器化程度低，可以进行定性和定量检测，非常适合于现场监控及大样品量的初筛。但也存在假阳性的问题，因此检测为阳性的样品需要用LC-MS、GC-MS等仪器法进一步确证。

（3）ELISA检测方法作为一种快速筛查的手段，能够监测畜牧养殖中抗生素使用情况，从源头上阻止不合格牛奶进入生产和流通环节，为人们食用安全优质的奶制品提供一种新的技术保障手段。可满足相关残留检测国家标准，能满足我国市场和进出口食品检测需要。

5 结论

本项目在优化前处理方法的前提下，研制出用于检测牛奶样品中阿维菌素残留的ELISA试剂盒。该试剂盒的线性工作范围为0.5-40.5 μg/L，IC50为1.9 μg/L，对牛奶的检出限为2.0 μg/L；添加回收率范围为75.8%-104.8%，批内变异系数不大于12.7%，批间变异系数不大于14.2%，均未超过15%。试剂盒性能良好，可用于牛奶中阿维菌素残留的定性或半定量检测。

［1］朱娟娟.阿维链霉菌孢子色素生物合成及PhoR-PhoP双组分信号系统对阿维菌素产量的影响［D］.华中农业大学，2008.

［2］许其华.阿维菌素对羊寄生虫的驱杀试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2008，12：122-122.

［3］杨绍谊，崔涛，赵源，等.超高效液相-串联质谱快速检测牛奶中阿维菌素类毒素残留［J］.中国乳品工业，2012，40（8）：47-49.

［4］赵卫东，郑文杰，贺艳，等.酶联免疫法检测动物源性产品中阿维菌素残留［J］.食品研究与开发，2009，30（4）：127-130.

［5］曹爱华，孙惠青，徐金丽，等.甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在烟草及土壤中残留分析方法的研究［J］.中国烟草科学，2010，31（4）：64-68.

［6］农业部.动物性食品中兽药最高残留限量［Z］.农业部2002年235号公告.

［7］范国英，王顺岗，王自良，等.链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制及应用［J］.畜牧兽医学报，2008，39（3）：380-384.

Establishment of Pretreatment method for the Determination of Avermectins in Milk

Liu Ying1，Wu Xiaoping2*，Su Lifang2，Wang Wenjun2，Chen Yinhui2
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026；2.Beijing WDWK Biotechnological Corporation Ltd）

Toimproveavermectinspretreatmentmethodinmilksample，post-processingliquidas standard matrix was used to draw standard curve.The result showed IC50value was 1.9 μg/L same as PBS buffer measurements.The limit of detection（LOD）was 2.0 μg/L.The average recoveries of milk samples ranged between 75.8%-104.8%.Coefficients of variation（CVs）were not more than 15.0%.Two pretreatment methods were used to test the actual samples and result displayed values of post-processing method was closer to the instrument readings.So the kit can meet the national standard residue detection and can be applied in the market and entry-exit food testing.

Abamectin；Pretreatment；ELISA Kit；Milk

R446.61

E-mail：liuying@bjciq.gov.cn；*通讯作者E-mail：wuxiaoping@wdwkbio.com

国家质检总局科技计划项目（2013IK306）

2015-06-09