皮肤鳞状细胞癌组织中Axin1和Cyclin D1 mRNA的表达

梁俊琴伊力努尔·哈力甫邹云敏柴 莉普雄明∗

皮肤鳞状细胞癌组织中Axin1和Cyclin D1 mRNA的表达

梁俊琴1，2伊力努尔·哈力甫2邹云敏2柴 莉2普雄明2∗

目的： 检测皮肤鳞癌组织中Axin1和Cyclin D1mRNA的表达，探讨其与皮肤鳞癌发生发展的关系。方法： 采用实时定量PCR方法检测40例皮肤鳞癌和癌旁组织及40例正常人皮肤中Axin1和Cyclin D1mRNA的表达水平。结果： 皮肤鳞癌组织中Axin1 mRNA表达＜癌旁组织＜正常皮肤组织，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。皮肤鳞癌组织中Cyclin D1 mRNA表达＞癌旁组织＞正常组织，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。皮损病理分化越差，Cyclin D1 mRNA表达量越高，Axin1 mRNA水平在皮肤鳞癌的病理分级中表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论： Cyclin D1和Axin1可能在皮肤鳞癌的发生发展中起一定的作用，尤其是Cyclin D1与肿瘤分化程度相关。

皮肤鳞癌； Cyclin D1； Axin1； mRNA； 实时定量PCR

皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma CSCC）是常见的非黑素瘤性皮肤恶性肿瘤之一，具有侵袭性且易于转移，严重威胁患者的身体健康与生活质量，由此产生的大量社会和医疗负担不容忽视。其发病机制尚不清楚，近年来研究发现Wnt信号传导通路相关因子在CSCC的发生发展中起着重要的作用。1我们采用实时荧光定量RT-PCR（Taqman probe）法检测Wnt信号通路中负性调节因子Axin 1和下游效应分子Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌，癌旁组织和正常皮肤组织中的表达，探讨其临床意义，为皮肤鳞癌的发病机制及早期诊断提供理论依据。

1　研究对象与方法

1.1研究对象 收集本院皮肤科2012年1月至2014年6月临床资料完整的皮肤鳞癌患者40例，经过临床及病理活检确诊。按照组织病理分型标准，均为普通型。普通型按照Broders提出的公认四级法分为I～IV级；其中I级21例（52.50%）；II级12例（30.00%）；III级7例（17.50%）；未见IV级。其中男21例，女19例，年龄39.4～93.0岁，平均68.91±6.27岁，病程5～187个月，平均19.05±2.10个月。所有患者在近1个月未系统使用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物，近1周未局部外用药物治疗，且无严重系统性疾病或伴有其他肿瘤疾病。上述患者取鳞癌肿物及癌旁组织1～2 cm。40例正常人对照组取自整形科手术切除正常皮肤，两组年龄和性别的差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。上述手术标本切除后放置甲醛溶液固定制作石蜡切片，患者知情且签署皮肤肿瘤扩大切除术同意书。

1.2引物、试剂及仪器 反转录反应试剂 Prime ScriptTMRT reagent Kit、Perfect Real Time探针法RTPCR全新预混系统Real MasterMix（Probe）、Onestep PrimeScript RT-PCR Kit（日本TaKaRa公司）、紫外线分光度仪（美国通用电气公司）、实时定量PCR扩增仪（美国ABI公司）、荧光定量检测试剂盒。目的基因及内参照GAPDH，RPLPO，ACTB引物由软件Primer 5.0设计。

1.3实时定量PCR方法

1.3.1提取总RNA、合成cDNA QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA，RNA纯度及浓度均采用紫外线分光光度测定A值，纯度为A260/A280=1.8～2.0，浓度为250～1367 mg/L。按cDNA合成，总RNA定量2μL，加入逆转录酶和随机引物逆转录为cDNA，按照逆转录反应试剂盒说明操作。

1.3.2RT-PCR反应 实时定量PCR扩增反应，取2 μL cDNA，按照试剂盒制备反应体系，离心数秒，在PCR仪中扩增。引物特征见表1，表2。

表1　Axin 1引物特征

表2　CCND1引物特征

1.4统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，检验结果以¯x±s表示，3组比较用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1Axin1 mRNA在皮肤鳞癌组织、癌旁组织及正常组织的表达皮肤鳞癌组织中Axin1 mRNA表达低于癌旁组织和正常皮肤组织，差异均有统计学意义（P值分别为0.000；0.003）。癌旁组织中Axin1 mRNA表达低于正常组织（P值为0.000），差异具有统计学意义，见表3。

表3　Axin1mRNA在皮肤鳞癌组织、癌旁组织及正常组织的表达水平

2.2Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌组织、癌旁组织及正常组织的表达 皮肤鳞癌组织中Cyclin D1 mRNA表达高于癌旁组织和正常组织，差异均具有统计学意义（P值分别为0.000；0.000）。癌旁组织中 Axin1 mRNA表达高于正常组织，差异具有统计学意义，见表4。

表4　Cyclin D1mRNA在皮肤鳞癌组织、癌旁组织及正常组织的表达水平

2.3Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌不同病理分级的表达 Axin1 mRNA在皮肤鳞癌不同病理分级的表达差异无统计意义（P＞0.05）。Cyclin D1 mRNA在3种组织病理分级的表达差异均有统计学意义（P＜0.05），CSCC III级＞CSCC II级＞CSCC I级。病理级别越高，分化越差的皮肤鳞癌组织中Cyclin D1 mRNA的表达量越高，见表5。

表5　Axin1和Cyclin D1mRNA在不同病理分级皮肤鳞癌的表达

2.4Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌组织及癌旁组织中表达的相关性 Axin1 mRNA在皮肤鳞癌组织中低表达，Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌组织中高表达。但两者表达在皮肤鳞癌组织和癌旁组织中无相关性（rs=0.100，P=0.538；r=0.574，P=0.098），见表6。

表6　Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌组织及癌旁组织中表达的相关性

2.5Axin1和Cyclin D1mRNA在皮肤鳞癌组织的表达与患者年龄、病程相关性 经过Spearman秩相关分析Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌与患者年龄无关（P=0.081，P=0.710），与病程长短无关（rs= 0.053，P=0.692）

3　讨论

皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma CSCC）是起源于表皮或附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤，随着器官移植患者增加，患非黑素瘤皮肤癌和鳞状细胞癌的概率明显增加，是正常人的40～50倍，国外曾经报道一系列的心脏移植患者27%死于皮肤癌。2近来研究表明，除了紫外线照射、人乳头瘤病毒（HPV）感染、免疫抑制、慢性炎症、癌基因突变等因素。3另外还与一些遗传及表观遗传的因素有关，越来越多的分子信号转导通路在皮肤恶性肿瘤中的作用受到关注。Wnt/β-catenin信号通路作为经典Wnt信号通路可将信号分子通过级联方式，由细胞膜经过细胞质转导至细胞核，其不仅在胚胎发育、细胞再生中起着重要作用，而且其异常活动与多种恶性肿瘤的发生、发展有关，特别是在鳞癌的发病机制中发挥着重要作用。4

Axin1是Wnt信号转导通路中重要的负性调节因子，其与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-3β、结肠癌抑制因子（APC）构成的β-catenin降解复合物参与调节Wnt信号通路。5由于Axin是一种核质穿梭蛋白，调节β-catenin的核质分布，而胞质内游离的β-catenin能够转移至细胞核内与Wnt的靶基因结合调节细胞的增殖。国内报道Axin1在结肠癌、肝癌、神经上皮瘤和髓母细胞瘤等恶性肿瘤的错义突变中均可降低其表达水平。6本实验中皮肤鳞癌组织中Axin1mRNA表达量低于癌旁组织和正常皮肤组织，癌旁组织中Axin1 mRNA表达量低于正常组织。提示Axin1 mRNA表达在正常皮肤中，癌旁组织，皮肤鳞癌逐级减少，Axin1的减少或缺失可能受到肿瘤发生中其他信号通路的调控，也可能是Axin1本身发生突变细胞激活或抑制通路中下游靶基因的转录，改变了信号通路导致皮肤鳞癌的发生发展。De Robertis等7发现在检测出β-catenin异常增高的肝癌或直肠癌细胞中表达野生型的Axin会引发肿瘤细胞凋亡，从而暗示Axin作为癌症治疗靶点的潜在可能性。

Cyclin D作为细胞周期素中重要成员之一，与多种恶性肿瘤的遗传易感性有关，同时Cyclin D作为Wnt信号通路下游效应分子，可以通过与细胞周期素依赖性激酶结合而促进视网膜母细胞瘤基因（retinoblastoma gene Rb gene）的磷酸化，减少了细胞对外源性有丝分裂的依赖性，加速细胞增殖，也可以直接作用恶性肿瘤的转录过程中。8D型周期蛋白分为3个亚型：Cyclin Dl、Cyclin D2、Cyclin D3。Cyclin D1蛋白在肿瘤细胞周期起正向调控作用，该蛋白编码的基因是CCNDl基因，该基因位于1 lq13染色体。Cyclin D1作为G1期细胞周期素，是细胞周期中最重要的调控点，也是决定细胞周期的时间即G1向S期转换中起重要作用。Cyclin Dl主要调节细胞从细胞周期G1期向S期的转变以促进细胞增殖，当Cyclin Dl基因的扩增、染色体易位及Cyclin Dl基因多态性的发生时，其蛋白过度表达与恶性肿瘤的发生、侵袭、转移与复发等密切相关。9在本实验研究中发现Cyclin D1 mRNA在正常皮肤组织中、癌旁组织及皮肤鳞癌组织相对表达量逐渐增加。皮肤鳞癌组织中Cyclin D1 mRNA表达量明显高于癌旁组织和正常皮肤组织，癌旁组织中Cyclin D1 mRNA表达量也高于正常组织。Axin1mRNA在皮肤鳞癌组织中呈低表达，在正常组织中高表达；Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌组织中呈高表达，在正常组织中呈低表达。两者表达在皮肤鳞癌组织和癌旁组织中无相关性，但此结果尚不能完全排除Axin1和Cyclin D1在Wnt信号转导通路中相互作用参与皮肤鳞癌的发生。Cyclin D1与Axin1在皮肤鳞癌的发展及肿瘤细胞的恶化中是否具有协同作用需要进一步研究证实。

本实验研究结果显示Axin1的表达与患者年龄，性别无关，本实验中显示Axin1 mRNA在皮肤鳞癌的低表达与鳞癌组织病理分级无关。而Cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌的高表达与鳞癌组织的病理分级有关，分化越高皮肤鳞癌的Cyclin D1 mRNA的表达量相对越高，提示Cyclin D1可能参与了皮肤鳞癌发生发展的过程。本实验研究结论与Cyclin D1在其他组织的鳞癌表达情况一致。有证据显示Cyclin D1的过度表达常引起恶性肿瘤侵袭转移的能力增强，其表达不仅与复发有关，还与病变演进有关。

综上所述，皮肤鳞癌组织中Cyclin D1 mRNA的高表达或过表达与Axin1低表达或表达缺失提示Axin 1和Cyclin D1在皮肤鳞癌的发生发展中可能起一定的作用。两者可能为皮肤鳞癌的早期诊疗和预后判断提供参考具有重要的临床指导意义，然而Axin 1和Cyclin D1在皮肤鳞癌中的确切作用机制需要进一步探索研究。本研究为今后有关Wnt信号通路是否通过调节Axin 1和Cyclin D1而作用于皮肤鳞癌提供部分理论依据。

1赵辨.中国临床皮肤病学.南京：江苏科学技术出版社，2009. 1527-1529.

2刘柯，钱丽庭，陈珂.HPV、p16及p53与头颈部肿瘤患者的预后分析.中华放射肿瘤学杂志，2014，23（02）：112-113.

3张卫民，高岩.Wnt信号转导通路组成蛋白与口腔鳞状细胞癌的分化和增殖.中华口腔医学杂志，2005，40：491-494.

4王凯，李建远.Wnt/β-catenin信号通路与发育和疾病研究进展.中国创新医学，2012，9（11）：17-19.

5Nikuseva MartiĉT，Peĉina-Slaus N，Kusec V，et al.Changes of AXIN-1 and beta-catenin in neuroepithelial brain tumors. Pathol Oncol Res，2010，16（1）：75-79.

6 FangWQ，ChenWW，Fu AK，etal.Axin directs the amplification and differentiation of intermediate progenitors in the developing cerebral cortex.Neuron，2013，79（4）：665-679.

7 De Robertis A，Mennillo F，RossiM.Human sarcoma growth is sensitive to small-molecule mediated Axin stabilization.PLoS One，2014，9（5）：e97847.

8李峰，陈临溪.细胞周期蛋白D与细胞周期调控研究进展.国外医学·生理、病理科学与临床分册，2005，25（3）：270-273.

9Shen Y，Xu J，Jin J，et al.Cyclin D1 expression in Bowen's disease and cutaneous squamous cell carcinoma.Clin Oncol，2014，2（4）：545-548.

（收稿：2015-04-20 修回：2015-06-14）

·病例报告·

Expressions of Axin1 and Cyclin D1 m RNA in cutaneous squamous cell carcinom a

LIANG Jun-qin，YI Li-nuer，ZHOU Yun-min，et al.Xinjiang medical university 830011；Xinjiang Uygur AutonomousRegion People's Hospital the Dermatology Department，830011

Objective：To detect the expressions of Axin1 and Cyclin D1 mRNA in cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）in order to determine the relationship with the development of CSCC.M ethods：The levels of Axin1 and Cyclin D1mRNA in 40 samples of CSCC，adjacent skin of the CSCC lesions and 40 normal control skin sampleswere detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）.Results：The level of Axin1mRNA in lesions，adjacentskin and normal skin was reduced in a declined order，with significant differences（P＜0.05）and the level of Cyclin D1 mRNA was increased in turn（P＜0.05）.The less differentiated the CSCC was，the higher level of Cyclin D1 mRNA among different pathological grades（P＜0.05），but there was no significant difference in the level of Axin1mRNA among different pathological grades（P＞0.05）.Conclusion：Axin1 and Cyclin D1 in CSCC may play an important role in the development of CSCC，especially Cyclin D1.

cutaneous squamous cell carcinoma；Cyclin D1；Axin1；mRNA；RT-PCR

新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2015211C191）

1新疆医科大学，830011

2新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科，830011