抗菌肽LL37联合肽聚糖对单核细胞分化的影响

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抗菌肽LL37联合肽聚糖对单核细胞分化的影响

钱 青1白彦萍2钱 雷3李 明

3高春岩1申宇鸿1

目的： 明确LL37联合肽聚糖（PGN）对单核细胞分化的影响。方法： 健康成年人外周血单核细胞经LL37、PGN、LL37+PGN刺激培养，16 h后流式细胞术（FCM）检测细胞表面CD14、CD16、髓系细胞触发受体-1（TREM-1），5天后检测不成熟树突状细胞（iDC）表面标记HLA-DR、CD1a、CD86的表达。诱导形成的iDC与异体淋巴细胞共培养3天，FCM检测Th17细胞的表达，MTT法检测T细胞的增殖。结果： LL37+PGN组与PGN组、LL37组比较，CD14++CD16+单核细胞亚群比例、细胞表面TREM-1表达、iDC比例、T细胞增殖和Th17细胞比例均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论： LL37联合PGN诱导单核细胞向CD14++CD16+单核细胞亚群极化，最终导致T细胞增殖和向Th17细胞分化。

银屑病； 抗菌肽LL37； 肽聚糖； 单核细胞

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，是具有特定遗传背景（基因）的人群在环境（以感染为主）的作用下引起复杂的细胞免疫紊乱。除了自身反应性T细胞活化和表皮角质形成细胞异常增殖，固有免疫系统因细菌、真菌等微生物感染引起过度活化在疾病过程中也发挥重要作用。1其中，单核巨噬细胞活化，在病损部位产生炎症因子、趋化因子，导致炎症反应，并影响适应性免疫，诱导Th17形成，参与疾病的发生发展。2

抗菌肽LL37和细菌细胞壁主要成分肽聚糖（peptidoglycan，PGN）在银屑病发病机制中均发挥重要作用。3患者皮损中含有PGN的巨噬细胞比例升高，并导致T细胞增殖；4PGN还可诱导角质形成细胞（KC）分泌高浓度的LL37，导致皮损处和血液中LL37升高。5另一方面，LL37可作为免疫效应活化分子，减轻病原微生物对单核巨噬细胞的刺激。6因此，有必要探讨LL37联合PGN对单核细胞生物学功能的影响，阐明单核细胞在银屑病疾病过程中的作用。

1　材料与方法

1.1研究对象 选取健康志愿者10名，男、女各5名，年龄22.4±5.1岁，无自身免疫性疾病或近期感染史，经北京市和平里医院伦理委员会批准，征得志愿者知情同意并签订知情同意书，采集外周血。

1.2主要仪器与试剂 LL37购自Innovagen公司，PGN购自Invivogen公司，异硫氰酸荧光素（FITC）鼠抗人-CD14、叶绿素蛋白偶联物（PerCP-cy5.5）鼠抗人-CD16、PE-鼠抗人CD1a、PE-鼠抗人CD86、别藻蓝蛋白（APC）鼠抗人-HLA-DR单克隆抗体及同型对照购自BD公司，PE-鼠抗人髓系细胞触发受体-1（TREM-1）及同型对照购自R&D公司；RPMI 1640细胞培养液购自Gibco公司；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhlL -4）购自Peprotech公司；人淋巴细胞分离液（Ficoll）购自上海恒信；白细胞介素-6（IL-6）、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-23、粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）检测试剂购自Bio-Rad公司，用Luminex200流式荧光检测仪分析。Th1/Th17流式检测试剂盒购自BD公司。四氮唑盐（MTT）购自Sigma公司。流式细胞仪FACSCanto为BD公司产品。

1.3方法

1.3.1贴壁法分离健康志愿者单核细胞 健康成人静脉血经肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞（PBMC），用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，1500 rpm离心6 min，弃上清，RPMI 1640细胞培养液（10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L链霉素）重悬，置于37℃5%CO2孵箱培养2 h后倾去未贴壁细胞，再加入RPMI 1640细胞培养液，继续培养6 h，收集单核细胞，经FITC-鼠抗人CD14鉴定细胞纯度85%～90%，台盼蓝拒染法鉴定细胞存活率＞95%。

1.3.2LL37和PGN刺激单核细胞 将浓度为1× 105/mL的单核细胞接种在96孔或24孔培养板内，分别加入10μg/mL PGN、20μg/m L LL37、LL37（20 μg/mL）+PGN（10μg/mL），置于37℃ 5%CO2孵箱培养16 h后，收集部分培养孔，1500 rpm离心6 min，吸取上清液作细胞因子检测，收集细胞，PBS洗涤，分别用于流式细胞术（FCM）检测CD16、CD14、TREM-1平均荧光强度（MFI）或阳性细胞频率。其余细胞置于37℃ 5%CO2孵箱诱导形成不成熟树突状细胞（iDC），用rhGM-CSF（50 ng/m L）+rhlL-4（25 ng/m L）培养部分细胞作为对照组，培养至5天，收集细胞，PBS洗涤后，部分细胞用于 FCM检测CD14、HLADR、CD1a、CD86阳性细胞频率，部分细胞用于同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）。

1.3.3流式细胞术检测细胞表面受体 每100μL细胞培养液加入10μL各种流式抗体及同型对照，室温避光孵育30min，用1m L PBS洗涤2次，1500 rpm离心6 min，弃上清，加入400μL PBS重悬细胞。用FACSCanto检测，并采用BD FACSDiva软件分析数据。以所有细胞设门，读取细胞CD14、CD16、CD1a、HLA-DR、CD86、TREM-1平均荧光强度（MFI）或阳性细胞频率。

1.3.4混合淋巴细胞反应 取异体健康成人肝素抗凝外周血，用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，PBS洗涤，于37℃贴壁培养4 h后收集非贴壁细胞作为同种异体T细胞备用。将上述培养的iDC用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为1×105/mL，将iDC与T细胞按1∶10的比例接种于96孔板，终体积200 μL/孔，置于37℃ 5%CO2孵箱培养3 d，部分细胞采用MTT比色法检测T细胞增殖，其余细胞用FCM检测Th17细胞频率。

1.3.5MTT比色法检测 T细胞增殖 终体积200 μL/孔，加入100μLMTT（5 g/L）继续孵育4 h，离心弃上清后，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，孵育10 min，酶标仪检测A570值，结果以3复孔均值表示。

1.3.6Luminex200检测上清液细胞因子浓度 所有上清液收集后，立即储存在-80℃。按试剂说明书检测上清液IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-23、GMCSF，用Luminex200流式荧光检测仪分析。

1.4统计学方法 用Stata7.0统计软件对数据进行正态性检验，本次研究全部为计量资料，均为正态性分布，用均数±标准差表示，多组比较用单因素方差分析（ANOVA），作双侧检验，P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1LL37联合PGN对单核细胞分泌细胞因子的影响 LL37、PGN、LL37+PGN与单核细胞孵育16 h，检测上清液细胞因子浓度。与空白对照组相比，LL37组IL-6、TNF-α、IL-8降低，但IL-1β升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；PGN组IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-23升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。LL37+PGN组与PGN组比较，IL-6、TNF-α、IL-8降低，GM-CSF、IL-1β升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

2.2LL37联合PGN对单核细胞极化和TREM-1表达的影响 LL37、PGN、LL37+PGN与单核细胞孵育16 h，LL37组、PGN组与空白对照组比较，CD14++CD16+单核细胞亚群比例差异无统计学意义（P＞0.05）；LL37+PGN组与其它3组比较，CD14++CD16+单核细胞比例升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白对照组、LL37组比较，PGN组、LL37+PGN组TREM-1MFI均升高，但LL37+PGN组升高更显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。TREM-1MFI和CD14++CD16+阳性细胞频率（R4区）分别见图1和图2。

2.3LL37联合 PGN诱导单核细胞向iDC分化

LL37、PGN、LL37+PGN与单核细胞孵育5 d，FCM检测细胞表面CD1a、HLA-DR、CD14阳性细胞频率。LL37组、PGN组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），LL37+PGN组CD1a、HLA-DR、CD86阳性细胞频率增高，CD14阳性细胞频率降低，与其它3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。但诱导iDC形成的比例低于rhGM-CSF+rhlL-4诱导形成的iDC，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表3。

2.4iDC诱导T细胞增殖和Th17细胞分化 iDC与异体淋巴细胞共培养3 d，LL37+PGN组T细胞增殖显著升高，与其它3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。LL37+PGN组和PGN组均可诱导T细胞向Th17分化，但LL37+PGN组诱导的Th17细胞比例高于PGN组，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表4，Th17细胞流式检测图，见图3。

表1　单核细胞培养上清液细胞因子浓度

表2　中间型单核细胞比例和TREM-1表达

表3　单核细胞分化为iDC频率

表4　Th17细胞比例和T细胞增殖

图1　单核细胞TREM-1MFI

图2　单核细胞亚群检测

图3　Th17细胞阳性频率流式图

3　讨论

较多研究者认为PGN是诱发银屑病的重要因素，4此理论有下列依据：（1）银屑病患者存在肽聚糖识别蛋白家族3（PGRP3）和PGRP4基因突变；（2）在银屑病患者病变皮肤处可分离出识别细菌PGN的抗原特异性T细胞；（3）通过16S rRNA基因序列分析、革兰氏染色、免疫荧光等多种技术证实，在正常人皮肤的表皮、真皮和浅表脂肪组织都存在细菌及其产物，从而导致各种免疫细胞可与细菌相互接触。最常见的细菌包括葡萄球菌和链球菌等，另外，机体其他部位的感染，如：扁桃体、肠道、牙周炎也会诱发银屑病。

抗菌肽LL37在正常皮肤不表达，而在银屑病皮损中高表达，主要来源于皮肤角质形成细胞（KC），部分来源于趋化到局部的中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等免疫细胞。KC高表达LL37的诱因是创伤、感染和药物。LL37可防御机体免受微生物侵袭，但LL37通过多个机制参与银屑病的发病，如：LL37/ DNA、LL37/RNA复合物，分别以Toll样受体（TLR）9、TLR7依赖的方式激活浆细胞样树突细胞（pDC），还可以刺激KC分泌IFN-α、IL-1β、IL-6，激活髓样树突状细胞（mDCs），LL37/RNA复合物也可直接通过TLR-8依赖的方式激活mDCs。3

本次研究发现，LL37能减少PGN引起的单核细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-8等炎症分子，但促进分泌IL-1β、GM-CSF。LL37及其片段衍生的阳离子肽具有调节细胞因子分泌的功能，Ruan等6研究发现，LL37可通过抑制TLR2配体脂磷壁酸（LTA）活化p38MAPK和 Akt磷酸化，从而抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6等炎症分子，减少促炎细胞因子的释放。LL37的片段LL33可促进单核细胞分泌IL-1β。7

LL37可明显上调PGN对单核细胞TREM-1的活化，Amatngalim的研究也有类似的结果，8机制可能是LL37能影响了细胞膜的动力学，有助于PGN进入细胞内。9TREM-1活化可导致单核细胞产生IL-1β、GM-CSF、IL-8、髓过氧化物酶（MPO）、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子，从而放大炎症反应。10TREM-1活化还可诱导巨噬细胞向促炎型（M1）极化，抑制GMCSF活性可阻断此极化作用。11本次实验单核细胞经LL37联合PGN刺激培养16 h，观察到单核细胞向中间型（CD14++CD16+）极化，中间型单核细胞具有较强的抗原提呈和加工能力；经典型（CD14++CD16-）单核细胞具有很强的吞噬功能；非经典型（CD14+CD16++）单核细胞主要在血管内壁执行巡逻任务，在浸润组织后分化为巨噬细胞。12

单核细胞经LL37联合PGN刺激培养5 d，观察到iDC特征性标记CD1a及其MHCII分子HLA-DR表达增加，单核细胞特征性标记CD14表达显著下降，提示细胞在LL37联合PGN的刺激下逐渐向iDC分化。LL37和TREM-1在单核细胞分化为DC的过程中均可发挥调控作用。Bleharski等10用TREM-1活化性抗体活化单核细胞TREM-1，诱导单核细胞分化为iDC，高表达CD1a、CD86、和MHC II类分子，导致T细胞增殖。在缺氧微环境下，TREM-1在诱导单核细胞分化为DC的过程中发挥重要作用。13单核细胞在LL37存在的条件下，GM-CSF/IL-4诱导的iDC表面CD86、CD11b、CD11c和CD18表达增加。14

在机体免疫应答反应中，Th属于适应性免疫系统，DC等抗原提呈细胞接受刺激的抗原性质和微环境决定初始CD4 T细胞向Thl、Th2、Thl7等不同亚群分化。目前银屑病被界定为Thl/Thl7共同介导的免疫紊乱。Th1分泌干扰素1（IFN-γ）、IL-2和TNF-α等，Thl7则分泌IL-17和IL-22等细胞因子，这些细胞因子单独或者协同作用，引起银屑病的病理改变，拮抗Th1/Th17细胞因子的生物制剂对银屑病具有肯定的临床疗效。本次实验LL37和PGN诱导单核细胞形成的iDC与异体淋巴细胞共培养，诱导T细胞增殖和向Thl7分化。已证实，与正常皮肤相比，银屑病患者病损组织单核细胞来源的DC明显增多，15高表达MHC II类分子，并分泌IL-12和IL-23诱导Th细胞分化为Thl和Thl7。Hyder等16研究也表明，与健康人皮肤组织相比，银屑病患者皮损组织TREM-1阳性细胞约升高了3倍，经双色荧光染色检测，TREM-1阳性细胞主要包括：髓系树突状细胞（mDC）、内皮细胞、巨噬细胞。

综上所述，在LL37和PGN同时存在的情况下，单核细胞减少了TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的产生，但GM-CSF分泌增加，活化TREM-1，诱导单核细胞向中间型单核细胞极化，并进一步分化为iDC细胞，然后影响适应性免疫，导致Th17细胞分化增加。此机制可能在银屑病发生发展中具有重要作用。但是，本次研究是体外实验，与体内的免疫反应可能有较大差异。因此，通过阻断单核细胞向中间型单核细胞极化和iDC分化来治疗银屑病尚需进一步深入研究。

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（收稿：2015-01-29 修回：2015-05-14）

·临床研究·

Effect of antim icrobial peptides LL37 com bined w ith peptidoglycan on the d ifferentiation ofmonocytes

QIAN Qing，BAIYan-ping，QIAN Lei，et al.Department ofDermatology，Peking Hepingli Hospital，Beijing，P.R.China，100013

Objective：To determine the effectof antimicrobial peptides LL37 combined with peptidoglycan（PGN）on the differentiation ofmonocytes.Methods：Monocytes from peripheral blood of healthy adultswere cultured in themedium of LL37，PGN and LL37 combined PGN.The levels of triggering receptor expressed on myeloid cells-1（TREM-1），CD14 and CD16 were detected by flow cytometry（FCM）after 16 h culture.The levels of HLA-DR，CD1a and CD86 on immature dendritic cell（iDC）were detected by FCM after culture for 5 days.T cells proliferation and Th17 polarization were detected by MTT and FCM respectively after iDC cocultured with lymphocyte for 3 days.Results：The percentage of CD14++CD16+monocytes and Th17，the levels of TREM-1 and iDC and the proliferation of T cells in the LL37 combined PGN group were obviously higher than those in the PGN group and LL37 group（P＜0.05）.Conclusion：Antimicrobial peptides LL37 in combination with PGN can induce themonocytes differentiation into CD14++CD16+，which finally induce the proliferation of T cells and differentiation to Th17.

psoriasis；antimicrobial peptides LL37；peptidoglycan；monocytes

北京市东城区科技计划项目（编号：2014-4-005）

1北京市和平里医院，北京，100013

2北京市中日友好医院，北京，100013

3盐城市滨海县人民医院，江苏滨海，224500