阿维A对P物质诱导的HaCaT细胞一氧化氮合成及细胞增殖的影响

张彩晴王倩云郑 龙程晓峰冯 捷邹晓荣∗

阿维A对P物质诱导的HaCaT细胞一氧化氮合成及细胞增殖的影响

张彩晴1王倩云1郑 龙1程晓峰1冯 捷2邹晓荣1∗

目的： 确定阿维A对P物质（SP）诱导的HaCaT细胞NO合成和细胞增殖的影响。方法：细胞分为5组：空白组、SP组（10-5mol/L P物质）、小剂量组（10-8mol/L阿维A+10-5mol/L P物质）、中剂量组（10-7mol/L阿维A+10-5mol/LP物质）、大剂量组（10-6mol/L阿维A+10-5mol/LP物质）。应用硝酸还原酶法检测作用时间为30 m in时各组细胞培养上清液中NO含量，MTT法检测各组细胞增殖率。结果： 与对照组相比，小剂量组NO含量上升（P＜0.05），中剂量组无明显变化（P＞0.05），而大剂量组明显降低（P＜0.05）；中小剂量组细胞增殖率增加，而大剂量组下降（P＜0.05）。结论： 阿维A对HaCaT细胞一氧化氮的合成和增殖可能有双相调节作用。

阿维A； P物质； HaCaT细胞； 一氧化氮； 细胞增殖

阿维A是第二代维A酸类药物，临床应用较为广泛，主要用于治疗银屑病、重度痤疮、毛发红糠疹等角化异常性疾病。而一氧化氮（nitricoxide，NO）是一种广泛存在于人体内的小分子活性物质，一氧化氮可参与调节血管舒张、突触传递、巨噬细胞的杀菌活性及免疫反应等，是机体生理和病理生理过程中的一种重要化学性介质。具有双重作用的效果，一方面在生理状态下对维持机体的正常功能具有保护作用，另一方面NO生成过多时又可加重组织的损伤。1NO不仅调节炎性反应，而且也参与维护皮肤的自稳。2P物质是一种神经肽类物质，参与机体的生理和病理过程。而P物质和NO及细胞的增殖异常都会影响疾病的发生和发展，为探讨阿维A治疗皮肤疾病的作用机制。本研究初步探讨了阿维A在P物质作用下对体外培养的人角质形成细胞株HaCaT细胞NO合成及细胞增殖作用的影响。

1　材料与方法

1.1材料 NO测试试剂盒（南京建成生物工程研究所）；人角质形成细胞株HaCaT细胞（ATCC）；P物质（Alexis）；MTT（Sigma，USA）；高通道多功能微板测试系统（BMG Lab technologies，Germany）。

1.2方法

1.2.1NO含量的检测 将细胞置于含10%FBSDMEM培养基中培养，细胞培养条件为 37℃、5%CO2，当细胞生长达到70%～80%融合时进行传代。选择生长旺盛、状态良好的细胞用于实验。试验组：小剂量组（10-8mol/L阿维A+10-5mol/L P物质），中剂量组（10-7mol/L阿维A+10-5mol/L P物质）、大剂量组（10-6mol/L阿维A+10-5mol/L P物质），作用30 min后取上清液0.9 mL用硝酸还原酶法检测NO含量。NO含量（μmol/L）=（测定管吸光度值-空白管吸光度值）÷（标准管吸光度值-空白管吸光度值）×标准品浓度（100μmol/L）×样品测试前稀释倍数。

1.2.2MTT法 取对数生长期的 HaCaT细胞，用0.25%胰蛋白酶/EDTA常规消化，10%FBS-DMEM中和、离心，用3%FBS-DMEM培养基制成单细胞悬液。将培养板置37℃、5%CO2条件下静置培养24 h后取出，细胞贴壁生长的选作实验用，每孔加入10% DMEM培养液200μL；按上述细胞分组加液后。将培养板移入培养箱中。12 h、24 h后每孔中加入15 μL的MTT（5 g/L）。将培养板移入细胞培养箱，再次培养4 h后终止培养，弃孔内培养液后每孔加入150 μL的DMSO，37℃孵箱过夜，使结晶物充分溶解。在高通道多功能微板测试系统中振荡10 min，空白对照孔调零，在570 nm波长处检测每孔吸光度值（OD），记录结果。实验重复3次。

1.2.3统计学方法 计量数据以¯x±s表示，组间比较用单因素方差分析。

2　结果

2.1阿维A对HaCaT细胞培养上清液中NO含量的影响（图1）

图1　各组细胞NO含量

空白组细胞培养上清中的NO含量为53.13±5.94 μmol/L；对照组为83.99±3.13μmo1/L，小剂量组为123.20±6.56μmol/L，中剂量组为85.73±4.66μmol/ L，大剂量组为64.84±3.48μmol/L。经统计学分析，对照组与空白组相比，NO含量明显上升（P＜0.01）；与对照组相比，小剂量组 NO含量明显上升（P＜0.01），中剂量组变化不明显（P＞0.05）；大剂量组明显下降（P＜0.01）。

2.2阿维A对P物质作用下HaCaT细胞增殖率的影响，见表1。

表1　阿维A对HaCaT细胞增殖的影响

3　讨论

HaCaT细胞是正常突变的永生化人角质形成细胞株，体外传代超过140代，具有永生性，不具有成瘤性。因其许多生物学特性与原代角质形成细胞相同而成为研究人表皮细胞的有力工具。在生理情况下，SP、NO在体内均有表达；在病理状态下二者均与多种疾病相关。如Farber等3注意到皮肤中某些神经肽、尤其是SP在银屑病发病过程中的作用。Ormerod等4研究发现在银屑病皮损中NO合成增加，通过双盲法对17例银屑病患者局部使用NO合成抑制剂LNMMA与对照组比较研究发现L-NMMA能明显抑制银屑病患者皮损中NO合成，对治疗银屑病具有一定的疗效。目前很多临床试验显示，阿维A可明显改善银屑病患者的皮损。5，6而我们在前期的研究中发现，P物质可促进一氧化氮的合成并双相调节HaCaT细胞增殖。7

本实验采用硝酸还原酶法和MTT分析法研究了不同浓度的阿维A在P物质作用下对HaCaT细胞培养上清液中NO含量和细胞增殖率的影响，以探讨阿维A治疗皮肤疾病的作用机制。细胞培养上清液中NO含量检测结果表明，未加P物质的空白组细胞合成释放一定基础量的NO，对照组加入10-5mol/的P物质后，细胞上清液中NO含量明显增加（P＜0.01）。与对照组相比，小剂量组细胞上清液中，NO含量反而明显上升（P＜0.01），中剂量NO含量变化不明显，大剂量组NO含量下降，3组细胞上清液中NO含量均高于空白对照组。说明在小剂量阿维A作用下，阿维A与P物质可能有协同作用，可促进NO的合成；中剂量作用下，可能对抗了一部分因P物质导致的NO释放，因此其含量无明显变化；在大剂量情况下，可抑制因P物质引起的NO释放。

MTT结果显示，在12 h时与对照组相比，中小剂量组细胞增殖率增加；大剂量组细胞增殖率下降。作用24 h时，与空白组相比，对照组细胞增殖率下降；与对照组相比，小剂量组和中剂量组细胞增殖率增加；而大剂量组细胞增殖率下降。说明在SP刺激作用下，中、小剂量阿维A可促进细胞增殖；大剂量阿维A抑制细胞增殖。但国内覃璇等8报道1×10-6mol/L、5×10-6mol/L阿维A均可抑制HaCaT细胞增殖，与本实验结果不同。分析本实验结果的原因可能为：一方面，本实验以SP为刺激物，其浓度、作用时间对细胞产生的作用不同；另一方面，阿维A与SP之间可能存在相互作用，从而对细胞增殖和NO合成造成影响。

1Espey MG，Miranda KM，Feelisch M，etal.Mechanisms of cell death governed by the balance between nitrosative and oxidative stress.Ann N Y Acad Sci，2000，899（2-3）：209-221.

2GiustizieriML，Albanesi C，Scarponi C，et al.Nitric oxide donors suppress chemokine production by keratinocytes in vitro and in vivo.Am JPathol，2002，161：1409-1418.

3 Farber EM，Rein G，Lanigan SW.Stress and psoriasis，psychoneuro-immunologicmechanisms.Int JDermatol，1991，30（1）：8 -12.

4Ormerod AD，Copeland P，Shah SA.Treatmentof psoriasiswith topical NG-monomethyl-L-arginine，an inhibitor of nitric oxide synthesis.Br JDermatol，2000，142（5）：985-990.

5 Carretero G，Rubera M，Blingchon I，et al.Guidelines for the use of acitrine in psoriasis.Actas Dermosifilioger，2013，104（7）：598-616.

6 Dogra S，Yadav S.Acitrin in psoriasis：an evolving sccscenario. Int JDermatol，2014，53（5）：525-538.

7张彩晴，王倩云，郑龙，等.P物质对HaCaT细胞一氧化氮合成及细胞增殖的影响.中国麻风皮肤病杂志，2013，29（5）：317.

8覃璇，吴时，孙乐栋.阿维A对HaCaT细胞增殖的影响.暨南大学学报，2014，35（6）：561-563.

（收稿：2015-04-20 修回：2015-06-28）

·病例报告·

Effects of acitretin on the syn thesis of nitric oxide and the proliferation of HaCaT cells induced by substance P

ZHANGCai-qing，WANGQian-yun，ZHENG Long，etal.Department ofDermatology，323 HospitalofChinese PLA，Xi'an 710054

Objective：To determine the effects of acitretin on the synthesis of nitric oxide（NO）and the proliferation of HaCaT cells induced by substance P（SP）.Methods：The cellswere classified into the blank group，SP group，low dose acitretin combined SP group，moderate dose acitretin combined SP group and larger dose acitretin combined SP group.The level of NO in the supernatant of cell culture medium of HaCaT cells were detected by nitric aciddeoxidize enzymemethod after culture for 30 minites.The proliferation rate of HaCaT cells in all groupswas detected by MTT.Results：Compared with SP group，the level of NO in the low dose acitretin combined SP group was higher and that in the high dose acitretin combined SP group was lower（P＜0.05）.The proliferation of HaCaT cells in the low dose acitretin combined SP group and moderate dose acitretin combined SP group was higher and in in the high dose acitretin combined SP group was lower than that in the SP group（P＜0.05）.Conclusion：Acitretinmay had thebidirectional regulation on the synthesis of NO and the proliferation of HaCaT cells.

acitretin；substance P；HaCaT cells；nitric oxide；proliferation of cells

兰州军区科研计划项目（编号：CLZ12JB31）

1解放军323医院皮肤科，西安，710054

2西安交通大学第二附属医院皮肤科，西安，710004