响应面法优化芜菁皂苷提取工艺的研究

蒋卉，孟庆艳，蒲云峰，*

（1.塔里木大学南疆化工重点实验室/生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

响应面法优化芜菁皂苷提取工艺的研究

蒋卉1，孟庆艳2，蒲云峰2，*

（1.塔里木大学南疆化工重点实验室/生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

在单因素试验的基础上，以皂苷浓度为指标，应用响应面法中心组合试验优化芜菁皂苷的提取条件。确定了芜菁皂苷提取最佳条件为：提取温度61.49℃，提取时间8.16 h，液料比10.50∶1.00（mL/g），甲醇浓度67.30%。在该条件下的理论值为（183.98±5.20）μg/mL与实测值（178.34±2.06）μg/mL无显著差异（P＞0.05），说明回归模型拟合程度较高，可用于芜菁皂苷提取工艺的优化。

芜菁；皂苷；提取工艺；响应面法

新疆芜菁学名Brassica campestris L．（syn.B.rapa. L．），是十字花科芸薹属芸薹种下的芜菁亚种，新疆维吾尔族对其俗称恰玛古［1］。芜菁由于对环境的适应性强，产量高，在新疆干旱缺水的南部种植广泛，深受当地维吾尔族等少数民族居民喜爱，并是有较长食用历史的传统蔬菜之一。同时，新疆芜菁除含有大量营养素外，还含有挥发油、氨基酸、蛋白质、糖及糖苷类、皂苷、鞣质、酚类、有机酸、生物碱、黄酮、槲皮素等多种成分［2-3］，具有止咳、祛痰、平喘［4］、抗辐射、抗癌［5］、抗衰老、提高免疫力［6］、降血糖［7］等功能。

皂苷是天然植物中具有重要生物活性成分之一，据统计，有一半以上天然植物中含有皂苷［8］。目前，国内外对于皂苷的研究报道较多，然而新疆芜菁中皂苷的研究报道较少。并且国内关于皂苷的提取多以乙醇为溶剂，而国外文献多以甲醇为溶剂［9-10］。因此，本文以甲醇为溶剂，采用响应面法优化芜菁皂苷的提取工艺，为进一步研究新疆芜菁皂苷及开发利用提供的理论参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

芜菁：2013年11月购于阿克苏农贸市场，经塔新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室焦培培副研究员鉴定为十字花科芸薹属芸薹种下的芜菁亚种Brassica campestris L．（syn.B.rapa.L．）植物。齐墩果酸、乙醚、甲醇、硫酸、香草醛、正丁醇等均为分析纯试剂。

GZX-9240鼓风干燥烘箱：上海博讯实业有限公司；DZKW-D-2电热恒温水浴锅：北京永光明医疗仪器厂；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZD（III）循环水式真空泵：巩义予华仪器有限责任公司；TU-1900紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2方法

1.2.1原料预处理

新鲜芜菁切成1 mm～2 mm薄片，在70℃的条件下烘干，然后研磨成粉，过80目筛，冰箱冷藏备用。

1.2.2芜菁皂苷提取

准确称取芜菁粉4.0 g，以乙醚为溶剂，索氏抽提脱脂10 h，然后干燥去除溶剂，加入甲醇溶液，水浴回流浸提，然后抽提分离，收集滤液真空浓缩，再用蒸馏水定容至100 mL，取10 mL提取液用等体积水饱和正丁醇萃取2次，将2次萃取液混合并烘干，最后甲醇定容至50 mL，冷藏备用。

1.2.3皂苷含量测定

准确吸取皂苷溶液0.50 mL于25 mL试管中，加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL和77%硫酸5 mL，在70℃恒温水浴15 min，然后冷水浴10 min，以试剂空白为参比，在波长545 nm下测定其吸光度及皂苷浓度。

1.2.4数据处理

单因素试验结果方差分析采用软件DPS7.55分析，响应面试验回归分析采用软件Design Expert 8.0.6统计分析。

2结果与分析

2.1甲醇浓度对皂苷浓度的影响

参照1.2.2的方法，以不同浓度的甲醇提取新疆芜菁皂苷，每个处理重复3次，其结果见图1。

由图1可以看出，甲醇浓度对皂苷浓度的影响十分显著（P≤0.01），甲醇浓度越高，皂苷浓度越高，而当甲醇浓度超过60%时，随着甲醇浓度增加，皂苷浓度变化不显著（P≥0.05）。因此，从试验结果来看，提取芜菁皂苷的甲醇浓度以60%为宜。

2.2液料比对皂苷浓度的影响

参照1.2.2的方法，在液料不同的情况下，提取新疆芜菁皂苷，每个处理重复3次，其结果见图2。

图1　甲醇浓度对皂苷浓度的影响Fig.1Effect of methanol concentration on saponins concentration

图2　液料比对皂苷浓度的影响Fig.2Effect of ration of liquid to material on saponins concentration

由图2可以看出，随着液料比增加，皂苷浓度也显著增加（P≤0.01），而当液料比超过9∶1（mL/g）以后，随着液料比的增加，皂苷浓度的变化不显著（P≥0.05）。因此，提取芜菁皂苷的液料比以9∶1（mL/g）为宜。

2.3提取时间对皂苷浓度的影响

参照1.2.2的方法，分别提取2、4、6、8、10、12 h，测定其提取的新疆芜菁皂苷浓度，每个处理重复3次，其结果见图3。

图3　提取时间对皂苷浓度的影响Fig.3Effect of extraction time on saponins concentration

由图3可以看出，提取时间也对皂苷浓度存在显著影响（P≤0.01），随着提取时间增加，皂苷浓度也逐渐增大，而当提取时间超过8 h时，皂苷浓度增加缓慢，并且提取时间为8、10、12 h的皂苷浓度之间差异不显著（P≥0.05）。因此，提取芜菁皂苷的时间以8 h为宜。

2.4提取温度对皂苷浓度的影响

参照1.2.2的方法，分别在30、40、50、60、70℃下提取新疆芜菁皂苷，每个处理重复3次，其结果见图4。

图4　提取温度对皂苷浓度的影响Fig.4Effect of extraction temperature on saponins concentration

由图4可以看出，提取温度对皂苷浓度也存在显著差异（P≤0.01），随着提取温度升高，皂苷浓度也逐渐增大，而当提取温度超过60℃后，皂苷浓度随着温度的增加反而降低（P≤0.05）。产生这种现象的原因可能是，温度越高，分子运动越激烈，有利于皂苷的分离，然而甲醇的沸点为64.5℃，当水浴温度为70℃时，提取液中部分甲醇以气态形式存在，降低提取液中甲醇的有效浓度，导致皂苷浓度降低。因此，提取芜菁皂苷的温度以60℃为宜。

2.5响应面法优化提取条件的试验设计及结果分析

根据单因素试验结果，选择以提取温度、提取时间、液料比、甲醇浓度进行响应面优化试验，采用Design Expert 8.0.6软件辅助试验设计，试验设计及结果见表1。

表1　中心组合试验设计及结果Table 1The results of Central composite experimental design

续表1中心组合试验设计及结果Continue table 1The results of Central composite experimental design

运用Design Expert8.0.6对试验结果多元回归分析，方差分析结果见表2。

表2　回归方程方差分析结果Table 2The results of variance analysis of regression model

由表2中的P值可知，在试验范围内，C、D、D2对皂苷浓度影响达到极显著（P＜0.01），另外A对皂苷浓度的影响也相对较大（P=0.087 1＜0.10）。回归系数R2＝0.823 8，对其F检验，其F=4.88＞F0.01（14，15）=3.66，说明回归模型较好，其R2Adj=0.659 3，表明此模型能解释65.93%效应值变化。同时对模型F检验，该模型达到极显著（P=0.001 9＜0.01），失拟项P＝0.327 8＞0.05，表明模型的失拟度不显著，该回归模型预测值与实测值能较好的吻合。其拟合回归方程为：

根据表2中F值判断各因素对皂苷浓度影响的强弱，F值越大，影响作用越强。因此，各因素对皂苷浓度影响程度大小依次为甲醇浓度D＞液料比C＞提取温度A＞提取时间B。

由Design Expert8.06软件处理得到各因素交互作用的响应面图见图5。

图5　各两因素交互作用对皂苷提取浓度的影响Fig.5Response surface and contour plots for the interactive effects of four extraction parameters on saponins concentration

从图5可以直观地观察各因素交互作用对皂苷浓度的影响，随着甲醇浓度、液料比和提取时间增加，响应值先增加然后趋于稳定；而随着提取温度升高，响应值先增加后减少。虽然试验结果分析得出了响应面图，但方差分析结果表明该模型中因素之间交互作用不显著（P＞0.05）。

经回归分析得到的最佳提取条件为：提取温度61.49℃、提取时间8.16 h、液料比（10.50∶1.00）mL/g、甲醇浓度67.30%，在该条件下，模型预测的皂苷浓度为（183.98±5.20）μg/mL，同时做了3次平行验证试验，获得皂苷浓度为（178.34±2.06）μg/mL。对试验值与预3结果与讨论

测值进行t检验，t=1.88＜t0.05（3）=3.182，说明回归模型拟合程度较高，可用于芜菁皂苷提取工艺的优化。

目前，国内文献多以乙醇（非极性：7.7；极性：4.3）为溶剂提取皂苷，而国外文献多以甲醇（非极性：7.4；极性：6.0）为溶剂。甲醇与乙醇的汉森溶解参数较为接近，理论上均能提取皂苷。但从两者的沸点（甲醇：64.5℃；乙醇：78.4℃）来看，以甲醇提取皂苷，后续浓缩操作更容易，这可能是国外研究者选择甲醇的原因；然而乙醇具有低成本、低毒的优点，或许这是国内研究者选择乙醇的原因。试验结果也表明，无论是甲醇或乙醇为溶剂，均能较好地将皂苷分离出来。

通过响应面法优化提取芜菁皂苷的工艺，获得了优化工艺为：提取温度61.49℃、提取时间8.16 h、液料比（10.50∶1.00）mL/g、甲醇浓度67.30%，在此条件下理论值为（183.98±5.20）μg/mL，与试验值（178.34± 2.06）μg/mL差异不显著，说明试验的模型拟合程度较高，可用于芜菁皂苷提取工艺的优化。但是，试验结果显示，所选取的4个因素间不存在显著交互作用，如果这种情况下选用正交试验设计优化，无论是选用L9（34）还是L16（45）正交表，试验处理数至少减少一半，可大大提高了试验效率。这也说明尽管响应面法具有许多优点，广泛地应用于各个领域，但它并不一定是最理想的优化试验设计。

近年来，已有一些文献报道恰玛古（新疆芜菁）具有止咳、祛痰、平喘、抗辐射、抗癌、抗衰老、提高免疫力、降血糖等功能，对于芜菁中皂苷是否与这些功能有关，或与哪些功能有关都还缺乏相关的研究。因此，对新疆芜菁皂苷的分子结构及功能性质的研究，将是今后研究的重要内容之一。

［1］刘勇民.维吾尔药志（下）［M］.新疆：新疆科技卫生出版社，1999：334-335

［2］周芳，海力茜·陶尔大洪，郁文.维药恰麻古儿化学成分预实验［J］.海峡药学，2009，21（6）：100-102

［3］海力茜·陶尔大洪，马桂芝，王菁，等.HPLC测定维药恰玛古儿药材中槲皮素的含量［J］.中国现代应用药学，2013，30（2）：169-171

［4］海力茜·陶尔大洪，周芳，杨珊，等.维药恰麻古儿止咳、祛痰及平喘的药效学研究［J］.中成药，2011，33（4）：682-685

［5］肖春霞，张洪亮.恰玛古膏影响中晚期大肠癌化疗相关指标的临床观察［J］.亚太传统医药，2010，6（12）：30-32

［6］孙艳，安熙强.恰玛古蜜膏对小鼠免疫功能的影响［J］.中国医药导报，2010，7（6）：20-23

［7］艾克拜尔江·阿巴斯，李冠，王静.新疆芜菁多糖降血糖作用的研究［J］.新疆农业科学，2011，48（3）：471-479

［8］S G Sparg，M E Light，J van Staden.Biological activities and distribution of plant saponins［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，94（2/3）：219-243

［9］Soetan k O l，Oyekunle M A.Evaluation of the antimicrobial activity of saponins extract of Sorghum Bicolor L.Moench［J］.African Journal of Biotechnology，2006，5（23）：2405-2407

［10］Chetna Acharya，Noor Afshan Khan.A triterpenoid saponin from the seeds of Ricinus communis and its antimicrobial activity［J］.Chemistry of Natural Compounds，2013，49（1）：54-57

Study on Optimum Extraction Process of Saponins from Brassica campestris L．（syn.B.rapa.L．）by Response Surface Methodology

JIANG Hui1，MENG Qing-yan2，PU Yun-feng2，*
（1.Key Laboratory of Chemical Engineering in South Xinjiang/College of Life Science，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China；2.College of Life Science，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China）

To optimize extraction process of saponins from Brassica campestris L．，the central composite experiment method was used to extract saponins based on the single-factor experiments.In combination with single factor test results，the results of optimum extraction condition was as follows：extracted temperature was 61.49℃，extraction time was 8.16 h，ratio of liquid to material was 10.50∶1.00 mL/g，and methanol concentration was 67.30%.There wasn't significant difference between the predicted value（183.98±5.20）μg/mL and the actual value（178.34±2.06）μg/mL（P＞0.05）.It showed clearly that the fitting degree of regression model was well.The optimized extraction process was economical，simple，reasonable and practicable.

Brassica campestris L．；Saponins；extraction technology；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.010

2014-07-11

新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课题（BRYB1101）

蔣卉（1972—），女（汉），高级实验师，本科，学士，研究方向：天然活性成分分离与分析。

蒲云峰（1981—），男（汉），讲师，研究方向：食品科学与天然产物。