星点设计-响应面优化苦荞壳黄酮超声提取工艺

陈金娥，王亚君，赵志刚，刘勇麟，张海容

（山西省忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000）

星点设计-响应面优化苦荞壳黄酮超声提取工艺

陈金娥，王亚君，赵志刚，刘勇麟，张海容*

（山西省忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000）

利用响应面分析方法优化苦荞中黄酮的超声提取条件；在单因素试验的基础上，通过星点设计-中心组合法研究了超声功率、超声时间、超声温度、液固比对黄酮得率的影响。结果表明，黄酮最佳超声提取工艺条件为：超声提取功率50 W，超声提取时间26 min，超声提取温度53℃，液固比49 mL/g，提取次数2次，在此条件下黄酮得率为2.02%。

苦荞黄酮；响应面法；超声提取

苦荞亦称“鞑靼荞麦”（Fagopyrum tararium），是一种自然界中药食两用的谷类作物，主要产于贵州、四川、云南［1］、山西等地方，富含生物类黄酮、淀粉、维生素、纤维素、脂肪、微量元素和矿物质及蛋白质等多种生物活性成分。苦荞作为一种药食两用植物，富含以芦丁为主的黄酮类化合物。研究表明，黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老的作用，并且近年来有研究证明使用黄酮类化合物还可以降低癌症发病率［2］。

目前对苦荞皮中黄酮类化合物的提取［3-4］多采用碱提取酸沉淀法、索氏抽提法、乙醇浸提法等，但这些方法普遍存在提取时间长、提取产物难分离、产率不高，不适合工业化生产等缺点［5］。超声波提取法［6-7］应用于苦荞皮中黄酮的提取，具有省时、高效、易操作等优点，以乙醇为溶剂还能回收利用，降低成本，减少污染，环境友好等特点。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

苦荞购自山西省灵丘。苦荞壳置于真空干燥箱中60℃恒温3 h，粉碎、过40目筛，置于广口瓶备用。

1.1.2试剂

芸香叶苷：国药集团化学试剂有限公司；95%乙醇（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；亚硝酸钠（分析纯）：天津市天大化工实验厂；硝酸铝（分析纯）：北京化工厂；氢氧化钠（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂。

1.2仪器

AB204-N型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；752N型紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；KQ-100DB型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1工作曲线

测定方法参考文献［8］。以芦丁为标准品，采用硝酸铝法，在510 nm处测其吸光度值。绘制黄酮工作曲线，得回归方程：A=10.193C+0.009 8（R2=0.998 4，C单位mg/mL）。

1.3.2苦荞黄酮的提取及测定

准确称取0.2 g苦荞壳粉放入100 mL锥形瓶中按一定的液固比加入60%乙醇，超声提取一段时间后，高速离心10 min。重复提取后合并滤液。将提取液定容至25 mL。准确吸取3.0 mL待测液置于10 mL比色管中，加80%乙醇至5 mL，加入5%NaNO20.5mL，摇匀，放置6 min，加入10%Al（NO）30.5mL，摇匀，放置6 min，再加入4%的NaOH溶液4 mL，加80%乙醇定容至10 mL，摇匀，静置15 min；在波长510 nm处测定吸光度，代入下式计算黄酮含量（Y%）：

黄酮含量Y（%）=浓度（mg/mL）×稀释倍数×提取液体积（mL）/［原料干重（g）×103］×100%

1.3.3苦荞黄酮提取的单因素实验

准确称取苦荞壳0.2 g，对液固比、超声时间、超声温度、超声功率、提取次数进行单因素探索实验，分别考察这5个因素对黄酮收率的影响。

1.3.4Box-Behnken星点优化设计

为了分析各因素之间的交互作用对结果的影响，分析参数影响因素，得到最佳的提取工艺，试验在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken设计，以苦荞壳黄酮的提取率为考察目标，分别以超声功率、时间、温度、液固比对应四个独立变量A、B、C、D，实验的因素水平编码见表1。

2结果与讨论

2.1溶剂浓度的选取

分别用H2O，20%、40%、60%、80%乙醇，无水乙醇作溶剂，在超声功率60 W、时间30 min、液固比45∶1、温度40℃、提取次数2次条件下提取，选取最佳溶剂浓度，结果见表2。

表1　Box-Behnken星点设计因素水平表Table 1Factor levels of Box-Behnken design

表2　乙醇浓度对苦荞壳总黄酮得率的影响Table 2Effects of ethanol on the flavonoids rates of the tatary buckwheat shell

2.2单因素试验

2.2.1液固比对总黄酮得率的影响

在超声时间为30 min，超声温度为40℃，超声功率为60 W，提取次数为2的情况下。提取液固比分别为15∶1、30∶1、45∶1、60∶1、75∶1，提取液固比对提取率的影响见图1。

图1　液固比对总黄酮得率的影响Fig.1The influence of liquid-solid ratio on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

可以看出液固比较小时，黄酮产率较低，随着液固比的增加，产率逐渐增大。但是，过多的加水量带来的产率的提高并不显著，且会给后续分离工作带来很大负担。因此，最佳液固比选取45∶1mL/g。

2.2.2超声时间对总黄酮得率的影响

在液固比为45∶1，超声功率为60 W，超声温度为40℃，提取次数为2次的情况下。提取时间分别为5、15、25、35、45 min，提取时间对提取率的影响见图2。

图2　时间对总黄酮得率的影响Fig.2The influence of extraction time on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

可以看出25 min之前，随着超声时间的增加，黄酮产率逐渐升高；25 min之后，产率随超声时间延长逐渐降低。因此，选择最佳超声时间为25 min。

2.2.3温度对总黄酮得率的影响

在上述选定优化条件、提取次数为2次的情况下，提取温度分别为30、40、50、60、70℃，提取温度对提取率的影响结果见图3。

图3　温度对总黄酮得率的影响Fig.3The influence of temperature on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

实验表明，温度超过40℃时，黄酮产率快速增大，高温有利于苦荞壳总黄酮的快速溶出，因此，选择50℃为最佳提取温度。

2.2.4超声功率对总黄酮得率的影响

在液固比为45∶1，超声时间25 min，超声温度为50℃，提取次数为2次的情况下。提取功率分别为40、50、60、70、80 W，提取功率对提取率的影响结果见图4。

可以看出在一定范围内增加超声功率，黄酮产率随之升高；超声功率超过50 W，产率随功率升高而下降，其作用机理尚待进一步研究。因此，选择最佳超声功率为50 W。

2.2.5提取次数对总黄酮得率的影响

在液固比为45∶1，超声时间为25 min，超声温度为50℃，超声功率50 W的情况下。提取次数分别为1次、2次、3次，提取次数对提取率的影响见图5。

图4　超声功率对总黄酮得率的影响Fig.4The influence of ultrasonic power on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

图5　提取次数对总黄酮得率的影响Fig.5The influence of extraction times on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

提取2次后变化较小，考虑节时节能，提取实验均采取2次提取。

2.3响应面法实验结果

2.3.1响应面法实验结果分析

按表1利用设计软件Design-Expert，得到的四因素三水平的星点设计—响应面分析实验方案，计算结果见表3。

表3　实验方案及结果分析Table 3Results analysis and program of the design of response surface analysis methods

续表3实验方案及结果分析Continue table 3Results analysis and program of the design of response surface analysis methods

本实验中，5，10，16、22、23组为中心实验，其余均为析因实验，29个试验点分为析因点和零点，其中析因点是与自变量A、B、C、D所对应的三维顶点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。

2.3.2方差分析和回归方程

对表3实验数据进行多项拟合回归，建立回归方程Y=2.01-3.333×10-3A+0.017B+0.033C+0.05D+ 0.02AB+7.5×10-3AC-0.013AD-7.5×10-3BC-0.012BD-0.01CD-0.056A2-0.074B2-0.059C2-0.1D2。对模型进行方差分析，结果见表4。

表4　方差分析表Table 4The analysis of regression model

续表4方差分析表Continue table 4The analysis of regression model

由表4可知，本实验所选模型不同处理间差异较显著，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间线性关系是显著的，即这种实验方法是可靠的；变异系数（C.V.%值3.20）较低，说明实验有良好的稳定性；模型的相关系数R2= 0.843 8，说明该模型可靠性较好。从回归方程模型因变量的方差分析可知，模型一次项A（P=0.851 0），B（P= 0.354 8）差异不显著，C（P=0.076 3），D（P=0.012 3）差异显著，二次项D2（P=0.000 8）差异极显著。表明液固比对总黄酮得率的主效应明显。依据系数值可知因素的主效应关系为：液固比>温度>时间>超声功率［9］。

2.4响应面图分析

为了进一步考察4个试验因子：超声提取功率（A）、时间（B）、温度（C）、液固比（D）的交互作用以及确定最优点，对回归模型采用降维法分析，即可得到两因子的回归模型，并通过Design-Expert7.0软件绘制出响应面曲线图来进行直观的分析见图6～图11分别显示了6组以得率为响应值的趋势图，从响应面图可以直观地反应出两变量交互作用地显著程度。

图6　超声功率和时间对黄酮得率响应面Fig.6The mutual interactions of ultrasonic time and power on the yield of tartary buckwheat flavonoid

图7　超声功率和温度对黄酮得率响应面Fig.7The mutual interactions of ultrasonic power and temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoid

图8　超声功率和液固比对黄酮得率响应面Fig.8The mutual interactions of ultrasonic power and solid-liquid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

图9　时间和温度对黄酮得率响应面Fig.9The mutual interactions of ultrasonic time and temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoid

图10　时间和液固比对黄酮得率响应面Fig.10The mutual interactions of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

图11　温度和液固比对黄酮得率响应面Fig.11The mutual interactions of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

由图6和图10可看出，超声功率和时间及液固比和时间两个因素共同作用对响应供过响应值的影响较显著。由图8和图11可看出超声功率和液固比及温度和液固比两个因素共同作用对响应值的影响不显著［10］。

2.5最优工艺条件求取

为了进一步确定最佳点的值，对回归方程取一阶偏导等于零，可以得到曲面的最大点，求导方程整理得：

求解方程组得：A=－0.025 9，B=0.079 6，C=0.251 8，D=0.234 4。最后求得超声功率、时间、温度、液固比的最适值分别为：a=49.74 W，b=25.8 min，c=52.52℃，d= 48.5 mL/g。此时，黄酮的理论得率为2.022%。根据实际情况取最佳的提取工艺参数为：超声功率50 W、时间26 min、温度53℃、液固比49 mL/g。验证实验表明，得率为2.02%，与理论值相符。因此，采用响应面法得到的提取条件参数相对较为可靠，具有使用价值。

3结论

通过Design-Expert 7.0软件进行星点设计—响应面分析法，能够可靠地进行优化试验以及数据处理，本实验应用这一方法对苦荞壳黄酮提取的超声工艺条件进行了优化。在单因素的基础上应用DesignExpert 7.0软件四因素三水平的实验，确定出了苦荞壳黄酮超声提取的优化工艺条件为：超声功率50 W、时间26 min、温度53℃、液固比49 mL/g，得率为2.02%。实验证明，采用响应面法获得的苦荞中黄酮的超声提取工艺条件，数据准确，科学可行。

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The Study of Ultrasonic Extraction and Optimization on the Flavonoids of Tatary Buckwheat with Response Surface Analysis Methods

CHEN Jin-e，WANG Ya-jun，ZHAO Zhi-gang，LIU Yong-lin，ZHANG Hai-rong*
（Institute of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The ultrasonic extraction conditions of the flavonoids of the Tatary Buckwheat shell were optimized with response surface analysis methods on the basis of single-factor experiments.The effects of ultrasonic power，ultrasonic time，ultrasonic temperature，liquid to solid ratio on yield of flavonoids of the Tatary Buckwheat shell were investigated using a central composite design.The results showed that the best conditions of ultrasonic extraction flavonoids were as follows：50 W of ultrasonic extraction power，26 min of extraction time，53℃of extraction temperature，49 mL/g of liquid to solid ratio，two grade of extraction times by Design Expert 7，the yield of flavonoids was up to 2.02%in optimal condition.

the Tatary Buckwheat flavonoids；response surface analysis methods；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.006

2013-08-28

忻州师范学院重点学科建设项目资助计划（xk201402）；山西省高等学校教学改革项目（2015-100）；忻州师范学院应用化学创新实践基地（2013-31）；山西省教育厅重点建设学科项目（20141010）作者简介：陈金娥（1957—），女（汉），副教授，本科，主要从事植物成分分离分析。

张海容，男，教授，博士，主要从事有机分析。