红树林真菌PH1008胞外多糖增强小鼠免疫功能的研究

王英，贝宁，王永霞，裴华，*，杨文，饶朗毓

（1.中南大学基础医学院，湖南长沙410013；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199；3.海南省老年病医院，海南海口571100）

红树林真菌PH1008胞外多糖增强小鼠免疫功能的研究

王英1，2，贝宁3，王永霞2，裴华2，*，杨文2，饶朗毓2

（1.中南大学基础医学院，湖南长沙410013；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199；3.海南省老年病医院，海南海口571100）

研究一株分离自红树林真菌PH1008胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）对小鼠免疫功能的影响，评价其在免疫功能方面的应用价值。体外实验采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测该菌胞外多糖对小鼠脾细胞增殖的刺激作用和观察其对小鼠NK细胞杀伤活性的影响；体内实验以三组不同剂量EPS连续小鼠灌胃28 d后，进行脏体指数测定。分离自海南红树林的真菌PH1008胞外多糖在体外能刺激小鼠脾细胞增殖，具有促进NK细胞杀伤K526细胞的能力；增加小鼠脏体指数，增强固有免疫功能。产自海南红树林的真菌PH1008初步鉴定为近平滑假丝酵母菌，其胞外多糖具有增强小鼠免疫功能。

红树林真菌；胞外多糖；脾细胞；NK细胞

红树林是海岸潮间带特有的植被，生态环境特殊，有着丰富而独特的微生物类群，目前已分离鉴定的红树林真菌超过200种，成为海洋真菌的第二大类群。该环境中的真菌因其生态环境的特殊，可能存在大量具有独特生物学功能的代谢产物［1］。菌株PH1008是从海南省东寨港红树林国家自然保护区土壤中分离得到的一株真菌，经初步鉴定为近平滑假丝酵母菌，本实验初步研究了其对小鼠免疫功能的影响，现报告如下。

1材料和方法

1.1试剂和培养基

PH1008真菌胞外多糖由本课题组提取；香菇多糖（南京康海药业有限公司，国药准字H10950078），K526细胞：上海雅吉生物科技有限公司；胎牛血清：杭州四季青公司；RPMI-1640培养基：Gibco公司；ConA：Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

发酵培养基采用大豆粉玉米粉培养基（大豆粉10 g，玉米粉10 g，可溶性淀粉5 g，KH2PO40.5 g，50%陈海水定容至1 L，调pH 7.2）；细胞培养基：含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。

1.2实验动物

BALB/c品系小鼠，8～10周龄，购自长沙市天勤生物技术有限公司。

1.3方法［2-5］

1.3.1真菌胞外多糖的获取

PH1008真菌活化二代后，接种于发酵培养基，经摇床培养发酵5 d后，收集发酵液离心取上清。发酵上清液离心后，用冰乙醇4℃沉淀24 h，4℃条件下离心后，沉淀溶于去离子水中。链蛋白酶+Sevag法联合脱蛋白后，-50℃条件下冻干48 h后备用。

1.3.2EPS对小鼠脾细胞增殖的刺激作用

取5只BALB/c小鼠脱颈椎处死，无菌条件下取脾组织剪成块状，浸入Hank's液中，研钵反复研磨成匀浆，用200目筛网过滤，收集脾细胞悬液低速离心，弃上清，Hank's液洗涤2次。用含20%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×104/mL，加入细胞培养板，每孔100 μL，分别加入相应浓度实验药物100 μL（设3药物浓度：200、100、50 μg/mL），每一实验药物浓度设5个重复孔，5%CO2培养箱中37℃培养44 h。吸出孔中培养液100 μL弃去，分别加入5 mg/mL浓度的MTT20 μL，继续培养4 h后，分别于每孔加入150 μL二甲基亚砜，摇床低速振荡，使结晶物充分溶解，测吸光度值A490nm。同时设置实验对照孔和空白调零孔。

1.3.3EPS对小鼠NK细胞杀伤K526细胞的影响

用完全1640培养基将靶细胞K526细胞浓度为1×105/mL，小鼠脾细胞悬液浓度调为2×106/mL，分别吸取50 μL加入细胞培养板，使K526细胞：脾细胞之比为1∶20，在此基础上分别加入相应试验药物50 μL（设3个终浓度：150、100、50μg/mL）。EPS组加入EPS，香菇多糖组加入香菇多糖，同时设脾细胞对照、K526细胞对照和空白对照，5%CO2培养箱中37℃培养48 h后，分别于每孔加入MTT15 μL，续培养4 h后吸出上清，再分别加入150 μL二甲基亚砜，测吸光度值A570nm，计算NK细胞杀伤活性。

1.3.4EPS对小鼠脏体指数的影响

以BALB/c品系小鼠进行体内实验，评估胞外多糖对动物免疫功能影响。随机将小鼠分为3组，雌雄随机，每组15只，采用灌胃方式给予剂量1 mL实验药物。实验组给予磷酸盐缓冲液（PBS）溶解胞外多糖冻干粉末（50 mg/kg）溶液；阳性对照组给予PBS溶解香菇多糖（50 mg/kg）溶液；正常对照组给予PBS；1次/d，连续28 d。第28天给药后，12 h禁食不禁水，分别称体重，脱颈椎处死后剥离胸腺、脾脏、肝脏用滤纸吸去多余的血水称重，并计算胸腺/体重比值和脾脏/体重比值。

1.3.5统计学处理

2结果

2.1EPS对小鼠脾细胞增殖的影响

EPS组与香菇多糖组和对照组相比，P均<0.01，差异有统计学意义，EPS组各浓度组间比较P<0.01，差异有统计学意义，见表1。

表1　EPS对小鼠脾细胞增殖的影响（±s）Table 1Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

表1　EPS对小鼠脾细胞增殖的影响（±s）Table 1Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

注：#EPS组与对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义，组间比较，P< 0.05，差异有统计学意义。*EPS组与香菇多糖组比较，P<0.05，差异有统计学意义。

组别终浓度/（μg/mL）吸光度值（A）EPS组#2000.566±0.032 1000.350±0.029 500.266±0.038香菇多糖组*2000.350±0.016 1000.232±0.019 500.170±0.016对照组—0.120±0.010

2.2EPS对小鼠NK细胞杀伤K526细胞的影响

EPS实验浓度组均能增强NK细胞杀伤活性，见表2。

表2　EPS对小鼠NK细胞杀伤K526细胞的影响Table 2Effect of EPS on the indices of organs in Mice

2.3EPS对小鼠脏体指数的影响

菌株PH1008所产生的EPS于小鼠连续灌胃28 d后，与正常对照组相比，小鼠的胸腺/体重、脾脏/体重、肝脏/体重的脏体指数有显著性提高（P<0.01），见表3。

表3　EPS对小鼠脏体指数的影响（±s）Table 3Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

表3　EPS对小鼠脏体指数的影响（±s）Table 3Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

注：#与PBS组比较，P<0.01，差异有统计学意义；*组间比较，P< 0.01，差异有统计学意义。

肝脏指数/（mg/g）PBS组03.56±0.155.78±0.1859.98±0.17香菇多糖组504.47±0.14#7.43±0.17#62.16±0.23# EPS组254.28±0.17#6.34±0.21#61.96±0.21#* EPS组504.64±0.17#7.63±0.17#63.00±0.21#* EPS组1004.92±0.06#7.91±0.13#63.52±0.23#*组别剂量/（mg/kg）胸腺指数/（mg/g）脾脏指数/（mg/g）

3讨论

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外形成的易与菌体分离的可溶性多糖及多糖复合物，是微生物的具有多种生物活性的次级代谢产物［6］，近年来已成为大多学者的研究热点。目前，国内外研究也均证实胞外多糖具有多种免疫学功能［7-9］。海南红树林生长在热带、亚热带低能海岸潮间带上部，生长环境特殊，资源丰富，生活在其中的微生物其代谢产物也可能具有独特的生物学活性，因此对红树林微生物及其代谢产物的研究正逐渐受到人们的关注［10］。

本课题组从海南红树林中分离获得一株真菌PH1008，初步鉴定为近平滑假丝酵母菌，通过本次实验发现，该菌株所产生的胞外多糖与对照组和香菇多糖组相比，各浓度EPS组均能显著刺激小鼠脾细胞增殖和促进小鼠NK细胞杀伤K526细胞能力，并随着多糖浓度的增加而有增强效应，表现出剂量效应关系。动物体内实验发现，用不同剂量胞外多糖在连续灌胃小鼠后，对于小鼠脏体指数有较为显著的增强效应，且不同剂量组间比较，差异有统计学意义。由此可见，该菌株PH1008胞外多糖能明显增强小鼠机体的免疫功能。

本次研究的实验菌株分离自海南红树林，随着红树林微生物资源的开发利用和基因工程等技术的普及，对该菌株生物学性状、代谢途径和代谢产物结构的进一步研究，有助于开发该菌株相应的保健食品并为其开发提供理论参考。

［1］CHENG Zhong-shan，PAN Jia-Hui，TANG Wen-cheng，et al.Biodiversity and biotechnological potential of mangrove-associated fungi［J］.Forestry research，2009，20（1）：63-72

［2］Ruiz-Ruiz C，Srivastava G K，Carranza D，et al.An exopolysaccharide produced by the novel halophilic bacterium Halomonas stenophila strain B100 selectively induces apoptosis in human T leukaemia cells［J］.Applied microbiology and biotechnology，2011，89（2）：345-355

［3］Sawen E，Hutunen E，Zhang X，et al.Structural analysis of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus ST1 solely by NMR spectroscopy［J］.Biomolecular NMR，2010，47（2）：125-134

［4］裴华，牛丽娜，林英姿，等.一株红树林真菌胞外多糖免疫增强作用研究［J］.食品研究与开发，2012，33（9）：170-173

［5］刘天华，李乐乐，乔梦.产胞外多糖海洋细菌的筛选及鉴定［J］.山东师范大学学报（自然科学版），2011，26（2）：122-124

［6］Okuyama H，Orikasa Y，Nishida T.Significance of Antioxidative Functions of Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids in Marine Microorganisms［J］.Applied and Enviromental Microbiology，2008，74（3）：570-574

［7］王永霞，裴华，杨文，等.小鼠免疫细胞活性与光滑假丝酵母菌胞外多糖关系的研究［J］.海南医学院学报，2012，18（9）：1170-1176

［8］王舒宁.真菌多糖免疫调节作用的研究进展［J］.福建畜牧兽医，2009，3（3）：14-16

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［10］李海瑞，吴希哲，徐韶瑜，等.海洋真菌多糖（YCP）对小鼠淋巴细胞免疫功能的影响［J］.中国生化药物杂志，2007，28（2）：91-93

Study on EPS from Fungi Strain PH1008 Isolated from Mangrove on Immune Function in Mice

WANG Ying1，2，BEI Ning3，WANG Yong-xia2，PEI Hua2，*，YANG Wen2，RAO Lang-yu2
（1.School of Basic Medical Science，Central South University，Changsha 410013，Hunan，China；2.School of Tropical Medicine and Laboratory Medicine，Hainan Medical University，Haikou 571199，Hainan，China；3.Hainan Provincial Geriatric Hospital，Haikou 571100，Hainan，China）

Research on EPS from fungi strain PH1008 isolated from mangrove on immune function in mice to evaluate its value in terms of immune function.Effects of EPS on the proliferation of murine splenic cell and its cytolytic activity were detected by MTT assay；Every mouse were administrated with different concentrations EPS through stomach for 28 days，calculate the indices of thymus，spleen and liver to investigate the effects of EPS on immune function in vitro.EPS stimulated the proliferation of spleen cell promoted its cytolytic activity in vitro，increased body index in mice and enhance the innate immune function.EPS from fungi strain PH1008 isolated from mangrove enhanced immune function in mice.

Fungi；EPS；Spleen；NK cell

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.005

2015-02-14

国家自然科学基金资助（31260225）；海南省自然科学基金项目（309032）

王英（1979—），女（汉），实验师，在读硕士，研究方向：病原生物学与免疫。