脑心通胶囊对慢性低灌注血管性痴呆小鼠神经保护作用研究

马亚珂等

[摘要] 目的 研究脑心通胶囊对慢性低灌注损伤所致的血管性痴呆小鼠模型的神经保护作用。 方法 取54只C57BL/6小鼠行双侧颈总动脉缩窄术建立慢性低灌注血管性痴呆模型，将造模成功的45只小鼠随机分为模型组（n = 15）、Tempol组（n = 15）、脑心通组（n = 15）。另设假手术组（n = 10）。1 d后，Tempol组灌胃给予10 mg/mL Tempol溶液0.01 mL/（g·d），脑心通组灌胃给予脑心通350 mg/（kg·d），假手术组、模型组灌胃给予生理盐水0.01 mL/（g·d），连续给药28 d。采用Y迷宫检测脑心通胶囊对血管性痴呆小鼠学习记忆能力的影响；利用苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学法检测脑心通胶囊对海马CA1区组织学变化及星形胶质细胞标志物胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达情况。 结果 连续给药28 d后，与模型组[（53.53±19.63）%]比较，Tempol组、脑心通组进臂的自发交替百分比[（65.34±12.32）%、（65.19±4.85）%]明显增加（P < 0.05）。HE染色显示模型组C57BL/6小鼠的海马CA1区锥体细胞排列紊乱、稀疏，细胞周围间隙增大，细胞内出现空腔。Tempol组、脑心通组的锥体细胞空腔减小，形态基本接近正常，细胞周围间隙减小，接近正常形态。与假手术组[（27.01±6.18）个/mm2]比较，模型组海马区每平方毫米活化的星形胶质细胞数目[（49.93±4.67）个/mm2]显著增加（P < 0.05）；与模型组比较，Tempol组、脑心通组的GFAP阳性细胞数目[（38.71±11.67）、（40.68±8.57）个/mm2]明显减少（P < 0.05），结构明显改善，分枝少，胞体形态趋于正常。 结论 脑心通胶囊可明显提高慢性低灌注血管性痴呆小鼠的空间学习记忆能力，改善神经组织形态，同时抑制激活的星形胶质细胞数量，表明脑心通胶囊可以改善血管性痴呆C57BL/6小鼠脑组织的缺血性损伤。

[关键词] 脑心通胶囊；血管性痴呆；低灌注；神经保护作用；胶质细胞原纤维酸性蛋白

[中图分类号] R749.13 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）10（a）-0004-05

Study on neuroprotective effect of Naoxintong Capsules on vascular dementia mice with chronic hypoperfusion

MA Yake1 YANG Yue1 ZHAO Buchang2 JIA Lifu2 ZHAO Jing2 WANG Hong1 YU Wenwen1 ZHANG Lusha1

1.Institute of Chinese Medicine， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine National Key Laboratory of Modern Chinese Medicine （Cutivation）， Tianjin 300193， China； 2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co. Ltd.， Shaanxi Province， Xi'an 712000， China

[Abstract] Objective To study the neuroprotective effect of Naoxintong Capsules on vascular dementia mice caused by chronic hypoperfusion damage. Methods Fifty four C57BL/6 mice were taken double carotid artery coarctation operation to establish vascular dementia mice model with chronic hypoperfusion. Forty five successful modeling mice were randomly divided into model group （n = 15）， Tempol group （n = 15） and Naoxintong group （n = 15）. Ten mice were set as sham group. One day later， Tempol group was given orally administration of 10 mg/mL Tempol solution 0.01 mL/（g·d）， Naoxintong group was given orally administration of Naoxintong 350 mg /（kg·d）， sham group and model group were given orally administration of normal saline 0.01 mL/（g·d）， continued for 28 d. Y maze was used to detect the learning and memory ability of Naoxintong Capsules for vascular dementia mice. The hematoxylin-eosin （HE） staining and immunohistochemistry were used to detect the histological change of Naoxintong Capsules for hippocampus CA1 region and the expression of Naoxintong Capsules for the marker glial filament acidic protein （GFAP） of astrocyte. Results After successive administration for 28 d， compared with model group [（53.53±19.63）%]， the spontaneous alternation percentages of entering arm in Tempol group and Naoxintong group [（65.34±12.32）%， （65.19±4.85）%] were increased significantly （P < 0.05）. HE staining showed that pyramidal cells of hippocampus CA1 region of C57BL/6 mice in model group were arranged in disorder and dispersely， the peripheral space was enlarged， there was cavity in cells. The cavity of pyramidal cells in Tempol group and Naoxintong group was reduced， the cell morphology was almost normal， the peripheral space was reduced and got close to normal. Compared with sham group[（27.01±6.18）/mm2]， the activated astrocyte number every square millimeter of model group [（49.93±4.67）/mm2] was increased significantly （P < 0.05）； compared with model group， the number of GFAP positive cells in Tempol group and Naoxintong group [（38.71±11.67）， （40.68±8.57）/mm2] was decreased significantly （P < 0.05）， the construction was improved significantly， the branch was reduced， and the cell morphology was tended to be normal. Conclusion Naoxintong Capsules can significantly enhance the space learning-memory ability of vascular dementia mice with chronic hypoperfusion， improve the morphology of nervous tissue， and inhibit activated astrocyte number at the same time， which shows that Naoxintong Capsules can improve the ischemic injury of brain tissue in C57BL/6 vascular dementia mice.

[Key words] Naoxintong Capsules； Vascular dementia； Hypoperfusion； Neuroprotective effect； Glial filament acidic protein

血管性痴呆（vascular dementia）是由各种脑血管疾病如缺血性卒中、出血性卒中等所致的严重认知功能障碍综合征，是一种慢性进行性疾病[1]。造成血管性痴呆的原因，主要有缺血性脑损伤、脑血流减少、脑动脉硬化及脑神经细胞病变等[2-3]。目前国内外对血管性痴呆的治疗尚无确切的疗法和药物。脑心通胶囊是根据中医理论在经典方剂的基础上加味而成的中药复方制剂，由黄芪、丹参、当归、川芎、红花、乳香、没药、桂枝、地龙及水蛭等16味中药组成，具有益气活血、化瘀通络等功效。临床大量数据证实脑心通胶囊对心脑血管性疾病具有较好的治疗效果[4]。双侧颈总动脉微螺旋缩窄模型是新近出现的一种慢性低灌注缺血致血管性痴呆模型，更符合临床血管性痴呆的病理特点（图1）[5-6]，而国内鲜见应用该模型的报道。本研究采用该模型研究了脑心通胶囊对血管性痴呆的保护作用。

A为0.18 mm金属微螺旋的形态及内径；B为慢性低灌注血管性痴呆模型（双侧颈总动脉缩窄术）的构造图；C为实际造模后C57BL/6小鼠双侧颈总动脉的缩窄状态

图1 小鼠双侧颈总动脉微螺旋缩窄模型

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级C57BL/6小鼠64只，10周龄，雄性，平均体重（20.00±5.00）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养于天津市实验动物中心，分笼饲养，自由饮水，饲养温度为22～25℃，相对湿度为40%～60%，每周更换垫料2次。

1.2 仪器与试剂

0.18 mm金属螺旋环（Microcoil，SWPA/0.08×0.18×0.5×2.5，无锡萨密你弹簧有限公司中国）；大小鼠行为分析系统（Clever.Sys.Inc，美国）；Y迷宫（XR-XY1032上海欣软信息科技有限公司，中国）；LEICA S8APO体视显微镜（型号DFC295，LEICA，德国）；LSM710显微镜（CarlZeiss LSM710，ZEISS，德国）。脑心通胶囊（陕西步长制药有限公司，国药准字Z20025001）；Tempol（214000-25G，SIGMA-ALDRICH，中国）；异氟烷（河北一品制药有限公司，国药准字H19980141）；GFAP试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，BA0056）；其他试剂为市售分析纯。

1.3 方法

1.3.1 双侧颈总动脉微螺旋缩窄模型及实验分组 54只C57BL/6小鼠行双侧颈总动脉缩窄术：三溴乙醇（0.33 mL/20 g）麻醉后，脱毛备皮并固定，置于体视显微镜下。纵向剪开颈部皮层，分离左侧颈总动脉，将0.18 mm的金属环套在颈总动脉血管上（图1），将浸有生理盐水的纱布覆盖颈部。0.5 h后将其右侧颈总动脉分离，将0.18 mm金属环如前操作环套在右侧颈总动脉上。缝合颈部，苏醒后放回笼中。监测造模过程中慢性低灌注前后脑部血流变化。排除造模过程中出血死亡、术后未苏醒及慢性低灌注后血流值未下降的小鼠，共纳入45只小鼠。将造模成功的小鼠随机分为模型组（n = 15）、Tempol组（n = 15）、脑心通组（n = 15）。另设假手术组（n = 10），假手术组除不做0.18 mm金属环缩窄颈总动脉外，其他操作如上。假手术组、模型组术后1 d灌胃给予生理盐水0.01 mL/（g·d），Tempol组灌胃给予10 mg/mL Tempol溶液0.01 mL/（g·d），脑心通组灌胃给予350 mg/（kg·d）脑心通胶囊，连续给药28 d。

1.3.2 Y迷宫 术后28 d后进行Y迷宫实验。由A臂放入，在3个臂中自由活动480 s，记录480 s内小鼠在A、B、C三个臂的穿梭次数。按A、B、C三个臂选择性穿梭的次数（即每次经过中心象限后均进入不同于上一次进入的象限，如ABC或CAB或ACB，而不是BAB或ACA）与总穿梭次数的比值，比值越大，说明小鼠的空间记忆能力越好[7]。

1.3.3 苏木精-伊红（HE）染色 连续给药28 d后，磷酸盐缓冲液（PBS）和4%多聚甲醛各25 mL心脏灌流。取出脑组织后4%多聚甲醛固定。24 h后放入自动脱水机中进行脱水，石蜡包埋切片，选择海马部位的切片进行常规HE染色，于光镜下观察海马CA1区组织形态学改变。

1.3.4 星形胶质细胞激活 按照胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）试剂盒的说明进行SABC免疫组化染色（一抗稀释比为1∶100；二抗是即用型抗体），具体操作如下：①石蜡切片常规脱蜡经乙醇脱水，PBS（pH 7.4）冲洗5 min×3次；②3% H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗3次，PBS浸泡5 min；③置入盛有枸橼酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 6.0）的容器中，放入数控抗原热修复仪中加热至温度达到120℃，保持15 min，然后排气降温，取出切片，自然冷却至室温，PBS冲洗5 min×3次；④加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，37℃封闭30 min；⑤倾去多余的封闭液，滴加适当稀释的特异性一抗于切片上，4℃过夜；⑥PBS冲洗5 min×3次，除去PBS液，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次；⑦滴加即用型SABC溶液，37℃孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次；⑧DAB溶液显色，显微镜下观察染色强度，以控制反应时间，通常5～10 min，滴加蒸馏水终止反应；⑨苏木精复染2 min，蒸馏水冲洗10 min，盐酸酒精分化5 s，蒸馏水冲洗10 min；⑩梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。对照：用0.01 mol/L PBS代替一抗做阴性对照。拍照，观察星形胶质细胞激活情况。定量分析计数方法：于海马CA1区的锥体细胞层，在40×10倍光镜下随机选择5个视野，计算每平方毫米内的阳性细胞数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t法检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Y迷宫实验

自发交替百分比越大，表明动物空间记忆的能力越强。与假手术组比较，模型组小鼠慢性低灌注后空间记忆能力显著降低（P < 0.05）。与模型组比较，Tempol组、脑心通组进臂的自发交替百分比显著增加（P < 0.05）。各组别之间的Y迷宫总进臂次数差异无统计学意义（P > 0.05），表明各组小鼠常规的移动未受到双侧颈总动脉缩窄和口服脑心通的影响。见表1。

表1 脑心通胶囊对慢性低灌注血管性痴呆小鼠空间记忆能力的影响

注：与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05

2.2 HE染色

假手术组海马CA1区锥体细胞呈多层排列，且整齐紧密，结构清晰，分布均匀，神经细胞数目多，外形规则，细胞层3～5层，细胞圆形或椭圆形，染色较淡，染色质均匀，核膜边界清晰，核仁圆且明显，呈均匀淡蓝色或蓝色；模型组海马CA1区锥体细胞排列紊乱、稀疏，神经元细胞数目减少，可见嗜酸性神经细胞现象，细胞核体积变小，深染，呈固缩状或仅呈现很淡的蓝色甚至蓝色消失，细胞周围间隙增大，细胞内出现空腔，细胞间质成分颗粒状分布明显；与模型组比较，Tempol组、脑心通组神经细胞外形基本规则，细胞周围间隙较模型组小，细胞空腔现象比模型组轻，细胞间质成分呈显微排列，接近正常。见图2（封三）。

2.3 星形胶质细胞激活

活化的星形胶质细胞经GFAP阳性染色后呈棕黄色，周围有放射状突起，呈分支状，形态如蜘蛛样。阴性对照切片未见GFAP免疫反应产物。结果见表2、图3（封三）。假手术组C57BL/6小鼠的海马区仅见少量GFAP染色阳性细胞数目，染色浅，突起细、短（图3箭头所示）；与假手术组比较，模型组C57BL/6小鼠的海马CA1区GFAP染色阳性细胞数目明显增多（P < 0.05），细胞深染，突起变长、增粗和分支增多；与模型组比较，Tempol组、脑心通组海马CA1区GFAP染色数目减少（均P < 0.05），染色较浅，结构明显改善，分枝少，胞体形态趋于正常。

表2 脑心通胶囊对星形胶质细胞GFAP表达的影响（x±s）

注：与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；GFAP：胶质细胞原纤维酸性蛋白

3 讨论

血管性痴呆严重影响着中老年人的健康，是亟待解决的医学难题。慢性脑供血不足是血管性痴呆重要的诱发因素。从病理学上来说，脑白质损伤后海马区发生反应性的神经胶质增生并发玻璃样变或纤维化及脑部血管壁增厚的动脉硬化性病变等，此类病变可导致脑组织多区域的功能损伤[8]。目前国内对于慢性低灌注模型的构造多为结扎双侧颈总动脉[9-12]，对模拟临床患者的实际情况有一定局限。本研究采用小鼠双侧颈总动脉微螺旋缩窄模型探讨脑心通胶囊治疗血管性痴呆的药理作用，该模型对脑部进行慢性低灌注，脑部组织胶质细胞激活和白质损伤明显，更符合临床实际。

脑心通胶囊是在补阳还五汤的基础上增加虫类药和活血化瘀药而成的现代中药复方制剂，在临床上广泛用于治疗心脑血管性疾病[13]。相关文献提示脑心通胶囊可以通过抑制与炎症细胞因子及氧化应激反应有关的JAK2/STAT3信号转导通路，抑制神经细胞凋亡，改善神经功能缺损，减轻缺血再灌注对大鼠脑神经细胞的损伤，发挥神经保护作用，降低脑水肿程度，提高小鼠空间记忆能力[14-15]。本研究结果提示，脑心通可以改善慢性低灌注血管性痴呆模型小鼠空间学习记忆能力及组织学病理形态。

本研究中采用Tempol作为阳性药，是一种新型自由基清除剂。文献[16-17]提示Tempol可清除自由基，抑制脂质过氧化，抑制神经细胞的氧化损伤；Tempol预处理可以改变脑组织的氧化环境，对缺血缺氧损伤的脑组织神经功能的恢复具有保护作用[16-20]。

星形胶质细胞是中枢神经系统内为数最多、功能复杂的一类神经胶质细胞，对神经元的存活、脑组织损伤的修复有重要作用[21-25]。星形胶质细胞在脑组织受损时明显增加，早期的脑损伤应激性增加的星形胶质细胞可参与脑组织内相关修复作用，但过度增生的星形胶质细胞分泌相关抑制因子，参与瘢痕形成，影响神经纤维的传导和突触的构建，也可产生细胞炎性因子等，引发炎性反应，加快脑组织损伤[26-28]。GFAP是星形胶质细胞合成的重要骨架蛋白，GFAP表达程度可反映星形胶质细胞增生活跃程度。本研究发现脑心通胶囊可以抑制慢性低灌注损伤模型中星形胶质细胞活化，这可能是其神经保护作用机制之一。

[参考文献]

[1] 张梅，高吉国，赵腾，等.MCP-1与血管性痴呆[J].中国老年学杂志，2014，3（34）：1728-1730.

[2] Goldberg TH，Griffith JP. Can Alzheimer's or vascular dementia be prevented with control of vascular risk factors [J]. W V Med J，2011，107（3）：20-25.

[3] Black SE. Vascular cognitive impairment：epidemiology，subtypes，diagnosis and management [J]. J R Coll Physicians Edinb，2011，41（1）：49-56.

[4] 赵涛，王一民，刘娜，等.脑心通胶囊的立方之法探析[J].世界中西药结合杂志，2012，7（11）：994-995.

[5] Maki T，Ihara M，Fujita Y，et al. Angiogenic and vasoprotective effects of adrenomedullin on prevention of cognitive decline after chronic cerebral hypoperfusion in mice [J]. Stroke，2011，4（42）：1122-1128.

[6] Dong YF，Kataoka K，Toyama K，et al. Attenuation of brain damage and cognitive impairment by direct renin inhibition in mice with chronic cerebral hypoperfusion [J]. Hypertension，2011，10（58）：635-642.

[7] Oades R，Taghzouti K，Simon H，et al. Dopamine-sensitive alternation and collateral behavior in a Y-maze：effects of d-amphetamine and haloperidol [J]. Psychopharmacology（Berl），1985，85（1）：123-128.

[8] Hermann GE，Viard E，Rogers RC. Hindbrain glucoprivation effects on gastric vagal reflex circuits and gastric motility in the rat are suppressed by the astrocyte inhibitor fluorocitrate [J]. J Neurosci，2014，34（32）：10488-10496.

[9] Jana B，Radenovi L，Selakovi V，et al. Time course of motor behavior changes in Mongolian gerbils submitted to different durations of cerebral ischemia [J]. Behav Brain Res，2006，175（2）：362-373.

[10] Li H，Park JH，Yan B，et al. Neuroprotection of alpinia katsumadai seed extract against neuronal damage in the ischemic gerbil hippocampus is linked to altered brain-derived neurotrophic factor [J]. Lab Anim Res，2011，27（1）：67-71.

[11] 胡琴，陈春花，杨晓梅，等.养血清脑颗粒对蒙古沙鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元的治疗作用[J].解剖学报，2007，38（5）：520-523.

[12] 关莉，刘微，闫福曼，等.补阳还五汤对全脑缺血再灌大鼠皮层神经元NR1的影响[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（2）：22-24.

[13] Yatomi Y，Tanaka R，Shimada Y，et al. Type 2 diabetes reduces the proliferation and survival of oligodendrocyte progenitor cells in ischemic white matter lesions [J]. Neuroscience，2014，12（54）：214-223.

[14] 卢惠娴，黎艳，莫新.轻度血管性认知障碍患者血清同型半胱氨酸超敏C反应蛋白与颈动脉狭窄的关系[J].齐齐哈尔医学院学报，2014，35（12）：171-172.

[15] 薛婧，徐江涛，李景春，等.脑心通对急性低压低氧小鼠空间记忆功能及脑水肿的影响[J].现代生物学进展，2010， 5（10）：869-871.

[16] 曹岩岩，孟凌新，赵柏松，等.Tempol预处理对大鼠心肺复苏后脑内HIF-1α及VEGF变化的影响[J].广东医学，2014，35（4）：497-500.

[17] 苏晗，张洁.Tempol预处理对七氟醚麻醉下老龄大鼠术后认知功能的影响[J].陕西医学杂志，2015，44（2）：153-155.

[18] Fujita Y，Ihara M，Ushiki T，et al. Early protective effect of bone marrow mononuclear cells against ischemic white matter damage through augmentation of cerebral blood flow [J]. Stroke，2010，4（1）：2938-2943.

[19] 常玉林，于丽丽，杨强.七氟醚预处理对老龄大鼠术后认知功能障碍的影响及海马区炎性细胞因子含量在其中的作用[J].中国医药指南，2015，13（9）：1-3.

[20] 丘敏，曾维勇，刘微，等.补阳还五汤对脑缺血再灌注后星形胶质细胞connexin43影响[J].辽宁中医药大学学报，2015，7（5）：36-38.

[21] 李春桃，韩言秀，杜晓薇，等.三七三醇皂苷对糖尿病大鼠学习记忆能力及星形胶质细胞活性的影响[J].天津医药，2015，43（4）：364-366.

[22] 张利军，白宇，侯育青.三七三醇皂苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白表达的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（3）：747-748.

[23] 苗兰，曹进，徐立，等.维脑康干预大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究[J].世界中医药，2013，8（10）：1137-1141，1146.

[24] 赵见文，田军彪，张颜伟，等.化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影响[J].世界中医药，2012，7（1）：70-71.

[25] 樊凯芳，李晓亮，梁晓东，等.三化汤对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：181-184.

[26] 路雪雅，胡京红.复方人参健脑液对大鼠缺血再灌注脑细胞损伤的作用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（17）：208-211.

[27] 洪妙玲，黄伟青，刘佩仪，等.DADLE对大鼠急性全脑缺血再灌注后海马区神经元ERK信号通路和Caspase-3表达的影响[J].中国医学创新，2013，10（2）：7-9.

[28] 任岩，曹余恒，李杰萍，等.补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡和Caspase-3基因表达的影响[J].中国医学创新，2014，11（13）：16-18.

（收稿日期：2015-05-27 本文编辑：张瑜杰）