荷叶黄酮提取及对肉类腐败菌抑菌活性研究

刘晓艳，陈海光，叶思平，陈展豪

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

荷叶黄酮提取及对肉类腐败菌抑菌活性研究

刘晓艳，陈海光*，叶思平，陈展豪

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

研究乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间对荷叶黄酮提取得率的影响，通过正交试验优化了提取荷叶黄酮的最佳工艺条件。结果表明，50%（体积分数）乙醇，提取温度为70℃，料液比为1∶40（m/v），提取时间1.5 h，荷叶黄酮的得率为0.87%。测定了荷叶黄酮对5种肉类腐败菌的抑菌效果，最小抑菌浓度实验结果显示：荷叶黄酮对大肠杆菌、荧光假单孢菌、铜绿假单孢菌、酵母菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为5.30、6.26、6.26、5.30 mg/100 mL，对大肠杆菌、荧光假单孢菌、酵母菌的最低杀菌浓度（MBC）分别为5.30、6.26、6.26 mg/100 mL。

荷叶；黄酮；提取；抑菌

荷叶（Nelumbo lotus leaf）是睡莲科莲属植物莲（Nelumbo nucifera）的叶片，是一味常用中药。荷叶除含有普通植物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质、单宁等常规化学成分外，还含有多种生物碱和黄酮类化合物[1]。在1991年11月中华人民共和国卫生部监发（1991）第45号文件中，荷叶被列入第二批“既是食品又是药品”的名单之一，其毒理方面评价为对人体基本无毒[2]。我国的荷叶资源虽然十分的丰富，但被利用的程度却很低。

荷叶提取物的主要功能性成分是黄酮、生物碱和挥发油。其中，荷叶黄酮对意大利青霉菌（Penicillium italicum）、红酵母（Rhodotorula）有较强的抑制作用[3]。荷叶生物碱对葡萄酒酵母、大肠杆菌（Escherichiacoli）；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcusbacilli）等表现出较强的抑制活性[4]。所以荷叶抑菌活性成分可作为一种廉价而安全有效的天然防腐剂，用于解决某些食品中过多使用化学防腐剂而带来的安全问题。

本文优化荷叶中黄酮的提取工艺，并就荷叶黄酮对5种常见的肉类食品腐败菌的抑菌活性进行研究，为荷叶抑菌资源的合理开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 荷叶

荷叶采摘自佛山市顺德区，8月份的新鲜荷叶，淋洗沥干后于70℃鼓风烘干至含水率8%以下，粉碎，过18目筛，用PEP复合膜袋装，封口扎紧置于干燥器内，备用。

1.1.2 菌种

大肠杆菌（E.coLi），荧光假单胞菌（P.Fluorescens），铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），蜡叶芽枝霉（Cladosporium herbarum），酵母菌（Saccharomycete）。

1.2 试剂

无水乙醇（AR）：天津市富宇精细化工有限公司；芦丁：上海潜维化工有限公司；亚硝酸钠（AR）、葡萄糖（AR）：广州化学试剂厂；硝酸铝（AR）：天津市科密欧化学试剂开发中心；氢氧化钠（AR）：天津市德恩化学试剂有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂粉、酵母膏：广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

GZX-9070ME分光光度计数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；RE-52C旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；620高速粉碎机：北京环亚天元机械技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 标准芦丁曲线的绘制[5]

用电子天平精密称取0.079 g芦丁（亦称阿拉丁）粉，放入烧杯中。取用无水乙醇，将其配置成体积分数为30%（体积分数）的乙醇溶液，然后溶解称取好的芦丁，完全转移到250 mL容量瓶中定容，备用。

分别准确量取0、1、2、4、6、8、10 mL芦丁标准溶液于25 mL的容量瓶中，用体积分数30%的乙醇溶液稀释到12.5 mL，加入0.7 mL质量分数5%的NaNO2溶液，摇匀，静置5 min，再加入0.7 mL质量分数10% Al（NO）3溶液，摇匀，静置6 min，再加入5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，用体积分数30%（体积分数）的乙醇溶液定容至25 mL，混匀放置10 min后，分别置于分光光度计下用510 nm可见光测量吸光度，记录并做出曲线。

1.4.2 荷叶黄酮的提取

准确称取经粉碎干燥荷叶1 g→用浸提剂冷凝回流提取→冷却→抽滤→除杂→浸提剂定容

1.4.3 荷叶黄酮抑菌试验

1.4.3.1 抑菌圈的测定[6]

用移液枪吸取上述各种菌悬液2 μL，加入到以固定好牛津杯的培养基上，并涂布均匀，将牛津杯拔出，往牛津杯洞里注入200 μL 3种不同浓度的样品溶液，作3个平行，另作一个生理盐水作空白对照，于37℃恒温环境下培养（其中细菌为24 h，真菌为48 h），然后取出，测定抑菌圈大小，并与牛津杯直径作比值。每菌作3次重复。

1.4.3.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定[7]

荷叶黄酮提取液经过提取浓缩后，提取液浓度为0.496 mg/mL，把荷叶黄酮提取液按不同体积（1 000、1 300、1 700、2 000 μL）加入到已灭菌的培养皿中，然后往培养皿中加入15mL的相应的培养基，并迅速晃动混合均匀，配制成质量浓度分别为3.1、4.06、5.3、6.25 mg/100 mL的荷叶黄酮溶液的系列培养基。取供试菌液100 μL置于了培养基表面并涂布均匀。混合后置于恒温箱中培养（细菌在37℃下恒温培养24 h，真菌在28℃下恒温培养48 h），以未加黄酮提取液的培养基作为对照。观察抑菌现象，以不长菌的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

1.4.3.3 最低杀菌浓度（MBC）的测定[8]

将提取物的浓度高于及等于MIC的培养皿继续培养24 h，观察菌体的生长情况，以仍无菌生长的最低添加量为该提取物的MBC值。

1.5 数据处理统计与分析

每个试验测定均重复3次，用Excel软件对所有数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 标准芦丁曲线的测定

2.1.1 检测波长的选择

用440 nm至715 nm波长对标准芦丁样液进行扫描，结果表明其在510 nm处有波峰。故选择510 nm作为最佳波长测定提取物的吸光度，如图1。

图1 芦丁标准溶液吸光波峰Fig.1 Rutin absorption wavelength scan

2.1.2 标准芦丁曲线

标准芦丁曲线见图2。

从图2中可以看出，该芦丁标准曲线是以芦丁浓度作为x轴，吸光度作为y轴的，回归方程为y= 11.257x+0.000 6，回归系数R2为0.999 9的直线。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对荷叶黄酮得率的影响

乙醇浓度对荷叶黄酮得率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对提取黄酮得率的影响Fig.3 Effect of Ethanol Concentration on the yield of flavonoid

由图3可以看出，随着乙醇浓度的增加，黄酮提取率增加，当乙醇浓度达到50%（体积分数）时，黄酮类化合物溶解度最大，黄酮得率最高；随着浓度的增加，提取效果反而降低由于黄酮是一大类物质，部分是水溶性的，部分是醇溶性的[9]。这是由于存在一些醇溶性的杂质，这些成分与黄酮类化合物竞争并同乙醇-水分子结合，从而导致黄酮类化合物的减少，黄酮得率减少。故本试验选择乙醇浓度为40%～60%（体积分数）范围内较为合适。

2.2.2 料液比对荷叶黄酮得率的影响

不同的液料比会影响到提取溶剂对活性物质的溶解情况。液料比过低，活性物质不能充分溶解，影响到提取率。液料比过高，虽然能充分溶解活性物质，但工艺成本受到影响。

料液比对荷叶黄酮得率的影响见图4。

图4 料液比对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of Solid-Liquid Rat on the yield of flavonoid

从图4中可看出，随料液比的增大，黄酮得率增加，但料液比达到1∶30 g/mL，随着固液比的提高荷叶黄酮提取效果的提高已不是很明显，这是由于存在一些杂质，如单宁酸以及一些色素的溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争并同乙醇-水分子结合，从而导致黄酮类化合物的减少，考虑到提取工艺成本，考虑提取范围在1∶25 g/mL～1∶35 g/mL范围内。

2.2.3 提取时间对荷叶黄酮得率的影响

浸提时间影响到溶剂与不同细胞位置活性物质的接触，并将其溶解提取出来。浸提时间越长，溶剂能够充分渗透到组织中，与活性物质充分接触溶解，从而提高产率[10]。

浸提时间对荷叶黄酮得率的影响见图5。

图5 提取时间对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of Extraction Time on the yield of flavonoids

从图5可看出，在一定时间内，随着提取时间的延长，黄酮得率增大，但提取时间达到1.5 h后随着时间增加，黄酮的得率减少，致使这一现象的可能原因是随着时间的推移有些在乙醇溶液中对热不稳定的黄酮类物质分解或转化引起黄酮含量反而降低[11]，因此最终确定提取时间在0.5 h～1.5 h范围内，黄酮得率较高。对产率的影响是浸提时间的作用之一，另一个方面需要考虑的是，浸提时间过长还会导致黄酮产物的表异构化作用。Row K H和Jin Y[12]在提取韩国茶叶中儿茶素的试验中指出，浸提温度80℃，浸提时间4 h的条件下部分儿茶素有表异构化现象出现。

2.2.4 提取温度对荷叶黄酮得率的影响

温度是物体分子平均动能的标志，一个物体的温度越高，分子运动就越剧烈。物体内部分子的平均动能就越大，物体温度的升到或降低。标志着物体内部的分子热运动的平均动能增加或减少。

提取温度对荷叶黄酮得率的影响见图6。

图6 提取温度对黄酮得率的影响Fig.6 Effect of Temperature on the yield of flavonoids

从图6中可以看出，随着提取温度的升高，黄酮提取率增加，当温度达到70℃后，黄酮得率变化不大，逐渐趋于平衡。考虑到提取工艺成本等原因，因此最终确定提取温度为60℃～80℃范围内。Sun J等[12]在提取水果中多酚类物质试验中指出，更高的浸提温度可以获得更高的多酚类产物得率，其原因可能是高温溶剂会促进细胞壁上的多糖类物质分散到溶剂体系，弱化了细胞壁的完整性，使得溶剂更易与多酚类物质接触，从而导致得率上升。

2.2.5 正交试验

根据单因素试验的结果及有关资料介绍，确定以乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度等4种因素进行正交试验，正交试验设计及结果见表1。

表1 正交试验设计及结果Table 1 Factor and level of orthogonal experiment and the Result

从表1可看出，4个因子中提取时间对黄酮提取率影响最大，由极差数据R可见，各因子对黄酮含量的影响主次顺序依次为提取时间（C）＞提取温度（B）＞乙醇浓度（D）＞料液比（A）；从表1直观上可看出，最优工艺条件为A3B1C3D2，即用50%（体积分数）乙醇，提取温度为70℃，料液比为1∶40（g/mL），提取时间1.5 h为合适，在此条件下，荷叶黄酮的得率为0.87%。

2.3 荷叶黄酮的抑菌特性研究

2.3.1 荷叶黄酮的抑菌圈

荷叶黄酮抑菌圈的测定结果见表2。

表2 荷叶黄酮抑菌圈的测定Table 2 Lotus leaves flavonoid antibacterial activity

由表2的抑菌圈的大小可以说明，荷叶黄酮对肉类常见腐败菌大肠杆菌（E.coLi）、荧光假单孢菌（P. Fluorescens）、铜绿假单孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）都有一定的抑菌作用，并且随着提取物浓度的增大，抑菌作用增强。在试验过程中还发现，在本试验所试的浓度下，荷叶黄酮的乙醇提取液对蜡叶芽枝霉（Cladosporium herbarum Link et Fries）的抑制作用不明显。

2.3.2 荷叶黄酮的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度

荷叶黄酮的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度见表3。

表3 荷叶黄酮最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）测定Table 3 The MIC and MBC of lotus leaves flavonoid

表3表明荷叶黄酮对肉类常见腐败菌大肠杆菌（E.coLi）、荧光假单孢菌（P.Fluorescens）、铜绿假单孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）的最低抑菌浓度（MIC）分别为5.30 mg/100 mL、6.26 mg/100 mL、6.26 mg/100 mL、5.30 mg/100 mL，对大肠杆菌（E.coLi）、荧光假单孢菌（P.Fluorescens）、酵母菌（Saccha-romycete）的最低杀菌浓度（MBC）分别为5.30、6.26、6.26 mg/100 mL。

3 结论与讨论

通过正交试验确定了由荷叶中提取出黄酮类化合物的最佳工艺条件，体积分数为50%（体积分数）乙醇，提取温度为70℃，料液比为1∶40（g/mL），提取时间1.5 h。在此条件下，荷叶黄酮的得率为0.87%。

荷叶黄酮对肉类常见腐败菌大肠杆菌（E.coLi）、荧光假单孢菌（P.Fluorescens）、铜绿假单孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）有一定的抑菌作用，并且随着提取物浓度的增大，抑菌作用增强，在同一浓度下对不同菌的抑菌效果不同。最小抑菌浓度实验结果显示：荷叶黄酮对大肠杆菌（E.coLi）、荧光假单孢菌（P.Fluorescens）、铜绿假单孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）的最低抑菌浓度（MIC）分别为5.30、6.26、6.26、5.30 mg/100 mL，对大肠杆菌（E.coLi）、荧光假单孢菌（P.Fluorescens）、酵母菌（Saccharomycete）的最低杀菌浓度（MBC）分别为5.30、6.26、6.26 mg/100 mL。在本试验所试的浓度下，荷叶黄酮的乙醇提取液对蜡叶芽枝霉（Cladosporium herbarum Link et Fries）的抑制作用不明显。

[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社, 2005:195

[2]范继善.实用食品添加剂[M].天津科学技术出版社,1993:124-125

[3]张赟彬,李彩侠.荷叶乙醇提取物的抗氧化与抑菌作用研究[J].食品与发酵工业,2005,31(10):21-24

[4]刘树兴,赵芳荷.叶生物碱的含量测定方法及抑菌活性研究[J].食品研究与开发2008,29(3):124-127

[5]冯涛.竹叶总黄酮提取及纯化工艺的研究[D].天津科技大学硕士学位论文,2003:1-10

[6]钱存柔,黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社, 2000:48-59

[7]张文治.新编食品微生物学[M].北京:中国轻工业出版社,1995

[8]徐叔云.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,1982:614

[9]刘成梅,游海.天然产物有效成分的分离与应用[M].北京:北京化学工业出版社,2003:170-237

[10]杨宝.荔枝壳功能性成分制备与生理活性研究[D].广州:华南理工大学,2008

[11]蒋益虹.荷叶黄酮的乙醇提取工艺优化研究[J].农业工程学报, 2004,20(4):170

[12]徐静.水果抗氧化活性与成分分析以及对衰老机体抗氧化功能的干预作用[D].中国人民解放军军事医学科学院,2006

Study on the Extraction and Antibacterial Activity of Lotus Leaves Flavonoid

LIU Xiao-yan，CHEN Hai-guang*，YE Si-pin，CHEN Zhan-hao
（College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

The effect of ethanol concentration，extracting time，temperature as well as solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoid from lotus leaves was studied in the paper.The optimized parameters were gotten by using the single factor and orthogonal design.It was shown that 50% （voluem ratio）of the ethanol concentration，70℃，solid-liquid ratio 1∶40（g/mL）and 1.5 h，the extraction rate of flavonoid reached 0.87%. The antibacterial activity of lotus leaves Flavonoid to 5 bacteria in meat was studied.It was shown that the minimum inhibition concentration （MIC）of lotus leaves flavonoid to E.coli，P.Fluorescens，Cladosporium herbarum and Saccharomycete were 5.30，6.26，6.26，5.30 mg/100 mL.The minimum bactericidal concentration（MBC）were 5.30，6.26，6.26 mg/100 mL.

Lotus leaves；flavonoid；extraction；antibacterial

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.008

广东省科技计划项目（2011B010500017）

刘晓艳（1978—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：农产品加工。

*通信作者：陈海光（1966—），男（汉），教授，硕士，研究方向：农产品加工。

2013-11-22