灵芝中灵芝酸的测定研究

孙金旭

（衡水学院，河北衡水053000）

灵芝中灵芝酸的测定研究

孙金旭

（衡水学院，河北衡水053000）

利用HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量的方法，此方法测定灵芝中灵芝酸含量重复性试验最大标准偏差为1.36%，峰面积与灵芝酸标品线性关系良好，标准曲线方程为Y=625.71x+82.857（R=0.998 2），加标回收率在97.04%～102.64%之间，此方法用于灵芝中灵芝酸含量准确、可行；经测定灵芝中灵芝酸为含量1.03 mg/g。

HPLC；灵芝酸；灵芝

灵芝酸是灵芝中除灵芝多糖之外的另一种重要的药理活性物质，灵芝酸一般分布在灵芝子实体的外周，日本以灵芝酸含量的高低来评价灵芝质量的好坏，他们认为含灵芝酸越高的灵芝，质量就越高[1]。近代研究表明，灵芝酸具有保肝、抗肿瘤[2-3]、降血糖[4]、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性，抑制胆固醇合成、镇痛、抑制血小板聚集、抗氧化等功能[5]。

近些年以来，测定灵芝酸类成分的主要方法为薄层层析法、紫外分光广度法，因灵芝酸成分种类繁多，结构相近，所以在资料控制和含量测定方面存在很大的困难，本研究建立了高效液相色谱法灵芝中灵芝酸含量的方法，以期快速、准确的对其进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝酸标准品：购于国家标准物质网浓度为100 μg/mL；乙酸、乙腈（色谱级）无水硫酸钠：购于潍坊中汇化工有限公司。

1.2 仪器

高效液相色谱：Agilent1100美国；旋蒸仪（型号：EV311）：莱伯泰科有限公司；电子天平：上海田宫称重制造有限公司。

1.3 样品等处理方法

1.3.1 灵芝酸标准液处理

准确秤取灵芝酸标准品10 mg，放入容积为100mL的容量瓶中，乙醇稀释至刻度，配置成浓度为1 mg/L的标准溶液，4℃冷藏备用。

1.3.2 灵芝酸的提取处理

适量秤取灵芝子实体，95%乙醇进行超声提取，灵芝子实体添加量0.05 g/L，提取温度，70℃，浸提时间12 h，浸提后过滤，取滤液，真空薄膜旋蒸处理，真空浓缩至干，得到提取物浸膏，该浸膏用氯仿溶解，反复用水萃取5次，取氯仿层，过滤，取滤液，用饱和NaHCO3溶液萃取3次，取NaHCO3萃取层，3次用盐酸调节至溶液pH为2～3之间，取沉淀物，沉淀物用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸处理，浓缩至干，得到粗灵芝酸。

1.4 HPLC测定条件[6]

HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量条件为：色谱柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6×250 mm）；流动相：2%乙酸：2%乙腈（体积比为7∶3）；流速0.3 mL/min；进样量10 μL外标法定量；柱温30℃；检测波长待定。

2 结果与讨论

2.1 测定波长的确定

为确定测定灵芝中灵芝酸高效液相色谱测定波长，以灵芝酸标准品为测定样品，紫外分光光度法进行其在200 nm～500 nm下的全波长扫描，扫描结果如图1所示。

图1 灵芝酸紫外全波长扫描结果Fig.1 The full wavelengh scanner result for Ganoderma lucidum acid

如图1所示，灵芝酸标准品在200 nm～500 nm下紫外扫描后，在254 nm处有唯一最大吸收峰，表明灵芝酸紫外测定的最适波长为254 nm。

2.2 标准品液相色谱图

HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量条件为：色谱柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6 mm×250 mm）；流动相：2%乙酸：2%乙腈（体积比为7∶3）；流速0.3 mL/min；进样量10 μL外标法定量；柱温30℃；检测波长254 nm，此测定条件下，灵芝酸标准品液相色谱图如图2所示。

图2 灵芝酸标品HPLC色谱图Fig.2 The HPLC spectra for Ganoderma lucidum acid

由图2可知，灵芝酸标准品在设定的测定条件下，在14.325 min处有单一峰，表明该测定条件适宜于灵芝酸的测定。

2.3 标准曲线制备及线性范围考察

准确称取一定量的灵芝酸标准品放入25 mL的容量瓶中，乙醇稀释至刻度，分别配置成浓度分别为0.2、0.4、0.6、2.0、4.0、8.0、10.0 ug/mL的标准溶液，此7份标准液在上述色谱条件下进样测定，以峰面积为纵坐标，以灵芝酸浓度为横坐标进行回归，得到线性回归方程Y=625.71x+82.857（R=0.998 2），该回归方程在1 μg～100 μg的范围内，线性关系良好。

图3 标准曲线及方程Fig.3 The standard curves and equation

2.4 重复性试验

精密称取同一份经处理后灵芝酸标准品，均匀的分为5份，经HPLC测定其中灵芝酸含量，计算平均值及RSD值，结果如表1所示。

表1 重复性试验Table 1 Result of repetitive test

同一份灵芝酸标准品分5次进样后，其RSD值为1.36%，表明该方法的重复性均达到分析的要求。

2.5 回收率试验

取经处理的灵芝后，平均分成3份，经处理后，分别测定灵芝酸含量，分别取灵芝酸标准品配置成不同浓度，添加入处理液中，经过滤膜过滤后分别测定灵芝酸含量，计算回收率，结果如表2所示。

由表2可知，经加标后，灵芝酸的回收率在97.04%～102.64%之间，表明回收良好此方法适宜于灵芝中灵芝酸含量的测定。

表2 回收率试验Table 2 Recovery rates

2.6 灵芝中灵芝酸含量测定

灵芝经处理后，得到灵芝酸粗提物，灵芝酸粗提物经几次萃取后，HPLC法测定其中灵芝酸含量，HPLC色谱图如图4所示。

图4 灵芝酸测定高效液相图谱Table 4 The HPLC spectra for the Ganoderma lucidum acid

有图4可知，在设定的高效液相色谱条件下，物质之间分开效果较好，各物质均能独立成峰，且由出峰时间判断含有欲测定的灵芝酸，表明该高效液相色谱条件较适宜于灵芝中灵芝酸含量的测定。

精确秤取灵芝10.00 g，经处理后，进样测定灵芝酸含量，结果利用该方法测定出灵芝酸含量为1.03 mg/g。

3 结论

利用HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量，测定条件设定为：色谱柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6 mm×250 mm）；流动相：2%乙酸：2%乙腈（体积比为7∶3）；流速0.3 mL/min；进样量10 μL外标法定量；柱温30℃；检测波长254 nm。研究表明：此方法测定灵芝中灵芝酸含量重复性试验最大标准偏差为1.36%，峰面积与灵芝酸标品线性关系良好，标准曲线方程为Y=625.71x+ 82.857（R=0.998 2），加标回收率在97.04%～102.64%之间，此方法用于灵芝中灵芝酸含量准确、可行；经测定灵芝中灵芝酸为含量1.03 mg/g。

[1]陈静,夏永辉,梁玲.灵芝有效成分生物活性作用的研究进展[J].云南中医中药杂志,2009,30(1):61-63

[2]郑琳,黄荫成.灵芝菌丝体活性三萜抗肿瘤活性的研究[J].农产品加工(学刊),2006(8):92-93

[3]Li C H,Chen P Y,Chang M,et,al Ganoderic acid X,a lanostanoid triterpene,inhibits topoisomerases andinduces apoptosis of cancer cells[J].Life Sci,2005,77:252-256

[4]金德宽.灵芝酸对人体糖代谢调节作用的研究[J].食品研究与开发,2012,33(11):202-205

[5]唐文.灵芝三萜类成分抑制拓扑异构酶Ñ活性的研究[J].上海应用技术学院学报:自然科学版,2011,11(2):90-93

[6]袁媛.高纯灵芝酸的分离纯化工艺研究[D].合肥工业大学,2007: 32-45

Determination of Ganoderma Lucidum Acid by HPLC

SUN Jin-xu
（Hengshui College，Hengshui 053000，Hebei，China）

The HPLC determination method for the determination of Ganoderma lucidum acid was established. The result showed that the maximum standard deviation of cholesterol content was 1.36%under this method for determination and Cholesterol content displayed an excellent linear relationship，the standard curve equation was Y=625.71x+82.857（R=0.998 2）.The spike recoveries for cholesterol were between 97.04%and 102.64%，the method was feasibility and accurate for using to determine Ganoderma lucidum acid，the average contents of Ganoderma lucidum acid was 1.03 mg/g by HPLC determination.

HPLC；Ganoderma lucidum acid；Ganoderma lucidum

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.004

孙金旭（1975—），男（汉），副教授，博士，主要从事发酵工程、食品等方面的研究。

2014-04-02