α2-f（56-57）：Y S的ACE活性抑制作用及在酸奶中的应用

孙振刚，武文起，冯永强，胡志和，赵勇

（1.天津海河乳业有限公司，天津300402；2.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

α2-f（56-57）：Y S的ACE活性抑制作用及在酸奶中的应用

孙振刚1，武文起1，冯永强1，胡志和2，*，赵勇2

（1.天津海河乳业有限公司，天津300402；2.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

评价乳源肽α2-f（56-57）：YS的血管紧张素转化酶（ACE）活性抑制作用及降压效果，并将其应用于发酵酸奶，制备具有降压作用的发酵酸奶。采用分光光度法检测α2-f（56-57）：YS对ACE活性的抑制作用，用不同剂量的α2-f（56-57）：YS及添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶灌胃原发性高血压大鼠（SHR），评价其降血压效果。结果表明，片段α2-f（56-57）：YS具有很好的ACE活性抑制作用，其IC50值为11.89 μg/mL；体内检测表明，用低、中、高（1、3、9 mg/kg mb）剂量灌胃原发性高血压大鼠（SHR），均显示有降血压作用，在灌胃后4 h，其血压分别降低了18.25、31.38和36.88 mm Hg，8 h后恢复到初始血压值。添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶，以10 mL/kg mb的剂量灌胃SHR，在灌胃后4 h，对SHR的收缩压（SBP）降低了32.5mm Hg，8 h后恢复到初始值。因此，α2-f（56-57）：YS具有降血压作用，应用于发酵酸奶中，可制备具有降压功能的酸奶。

ACE活性抑制肽；α2-f（56-57）：YS；发酵酸奶；降血压

随着人们生活水平的提高，生活方式和饮食结构发生了巨大变化，现代文明病，包括肥胖症、糖尿病、心血管疾病等，接踵而来。其中，心血管疾病的发病率在我国呈逐年快速上升趋势。心血管疾病以冠心病为主，冠心病又称冠状动脉硬化性心脏病，而高血压是动脉粥样硬化的重要危险因素[1]，且血压水平与心血管发病危险呈正相关[2]。在WHO/ISH、ESH/ESC和中国高血压治指南[3-5]中强调了控制收缩压的重要性，阐述了联合用药干预心血管危险因素的高血压治疗新观念，但降压药物都有一定的毒副作用[6]。

近年来研究发现，食物蛋白质水解后形成的一些小分子多肽具有明显的降血压作用，它与普通降压药物相比没有无毒副作用，且对正常的血压没有影响，因而成为目前抗高血压功能食品或药物研究的热点[7]。

目前，研究较多的是乳源降压肽，乳不仅能提供丰富的营养，而且还是许多生物活性肽的重要来源[8]。研究者采用蛋白酶水解的方法，从牛乳酪蛋白[9-13]和乳清蛋白[14-18]中分离出多种生物降血压肽，另外，还从发酵的乳制品中分离出多种具有降压功能的活性肽[19-24]。

本文利用胃蛋白酶和胰蛋白酶，先后水解乳酪蛋白，分离纯化获得肽片段α2-f（56-57）：Tyr-Ser（YS），对其ACE活性抑制作用及降血压作用进行评价，将其与乳混合发酵，制作具有降血压功能的发酵乳，为功能性乳制品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乳酪蛋白源肽α2-f（56-57）：YS：天津商业大学生物技术与食品科学学院专业实验室制备，经HPLC和MS分析纯度大于95%；直投式乳酸菌菌种（HANSEN YFL812 50U）：HANSEN公司；N-Hippuryl-His-Leu hydrate（HHL）、AngiotensinConvertingEnzymeACE：Sigma公司。

实验动物：原发性高血压大鼠（SHR），中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心；正常Wistar大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 实验仪器

FLUKOFA-25均质机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；LRH-70生化培养箱：上海一恒科技有限公司；UV-2100紫外-可见分光光度计：日本Unico公司；BP-2006A型智能无创血压计：北京软隆科技有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 α2-f（56-57）：YS片段的ACE活性抑制的体外检测

1.3.1.1 分光光度方法体外检测ACE活性抑制率

采用分光光度方法[25-26]体外检测ACE活性抑制率，具体方法见表1。

表1 ACE活性抑制体外检测方法Table 1 Detection method of ACE activity inhibition in vitro

硼酸钠缓冲液：含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸盐缓冲液（pH8.3）；HHL试剂：溶于硼酸钠缓冲溶液，配成浓度为5 mmol/L，分装后-20℃保藏；ACE试剂：将0.25U的ACE用2.5 mL的硼酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1 U/mL，分装后-20℃保藏；抑制剂：用硼酸钠缓冲溶液溶解样品至不同浓度。

根据表1，将各试剂加入到5 mL离心管中混匀（每管做三组平行），反应结束后加入1.7 mL乙酸乙酯，经15s振荡、混匀后离心（4 000 r/min，15 min，4℃），吸取1.0 mL乙酸乙酯层于试管中，在120℃的烘箱中烘干30 min后，向试管中加入3 mL去离子水，检测在228 nm处的吸光度，其计算公式为：

式中：A为反应中ACE抑制剂和ACE同时存在的细光度；B为反应中不加抑制剂的吸光度，即对照；C为ACE和HHL空白反应的吸光度，即空白。

1.3.1.2 半数抑制浓度（IC50）的测定

称取α2-f（56-57）：YS，分别配制成质量浓度为5、10、20、40、60 μg/mL的溶液，测定各溶液的ACE抑制率，并绘制ACE抑制率曲线，计算出IC50值。

1.3.2 添加α2-f（56-57）：YS发酵酸奶制备

按照100 mg杀菌的鲜牛奶添加60 mg的α2-f（56-57）：YS的比例混合，进行充分混合，接种0.06%直投乳酸菌（HANSEN YF-L812 50U），42℃发酵5 h，获得发酵酸奶。

1.3.3 α2-f（56-57）：YS及其发酵酸奶的动物实验

1.3.3.1 实验动物分组

12周龄雄性原发性高血压大鼠（SHR）40只，体质量为（260±15）g，自由采食饮水，保持环境温度（23± 1）℃，相对湿度（60±5）%，预饲养1周。大鼠随机分为4组，每组10只，分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别灌胃生理盐水（10 mL/kg mb）、低、中、高剂量的α2-f（56-57）：YS（灌胃剂量为1、3、9 mg/kg mb）。另取Wistar大鼠20只，分为2组，分别作为空白组和正常对照组，灌胃生理盐水和高剂量α2-f（56-57）：YS。灌胃后检测血压变化。

采用同一批SHR进行实验，间隔1周，待其血压恢复原值后再进行灌胃酸奶测试。取30只SHR大鼠，分为3组，每组10只，分别灌胃生理盐水、普通发酵酸奶和添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶，灌胃剂量为10 mL/kg mb。另取Wistar大鼠20只，分为2组，分别灌胃生理盐水和添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶。灌胃后检测血压变化。

1.3.3.2 动物血压测定

采用血压计，测定大鼠尾动脉收缩压（SBP）[27]。测定前，将大鼠固定于鼠网保温套中在39℃恒温预热，使尾动脉扩张，血流畅通。按照设计的剂量灌胃，每天灌胃1次，测定灌胃后1 h～8 h的尾动脉血压，连续测3次，取平均值。

1.3.4 实验数据处理

用SPSS17.0软件分析实验结果，比较各组与对照组之间差异的显著性，所得结果应用配对t检验，p＜0.05表明统计学有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 α2-f（56-57）：YS的ACE活性抑制作用检测

根据方法1.3.1，检测α2-f（56-57）：YS对ACE活性的研制作用，结果见图1。

图1 α2-f（56-57）：YS浓度与ACE抑制活性关系曲线Fig.1 Relationships between concentrations of α2-f（56-57）：YS and ACE inhibitory activity

根据拟合方程y=-0.0087x2+1.3878x+27.959计算α2-f（56-57）：YS对ACE活性的半数抑制率为IC50= 11.89 μg/mL，因此，该片段具有很好的ACE活性抑制作用。

2.2 α2-f（56-57）：YS降压作用的体内实验

按照方法1.3.3（1）设计的剂量，灌胃SHR和 wistar大鼠，用BP-2006A型智能无创血压计检测灌胃后其收缩压（systolic blood pressure，SBP）的变化，结果见图2和图3。

图2 灌胃片段α2-f（56-57）：YS对SHR血压的影响Fig.2 Antihypertensive effect of α2-f（56-57）：YS on the SBP of SHR

图3 灌胃α2-f（56-57）：YS对Wistar大鼠血压的影响Fig.3 Antihypertensive effect of α2-f（56-57）：YS on the SBP of Wistar

由图2可知，与生理盐水组相比，三种剂量的α2-f（56-57）：YS均具有很好的降血压的作用（p＜0.05），在灌胃后4h，各剂量组均达到最好降压效果，低、中高三个剂量组分别降低了18.25、31.38和36.88 mmHg。4 h后，血压开始缓慢回升，8 h后基本恢复到原来水平。该结果表明，α2-f（56-57）：YS片段在体内可经受胃肠环境的作用，结构不会发生变化，保持很好的降血压的功能。而对正常血压的wistar大鼠，在高剂量下灌胃，其血压无显著变化（p＞0.05）（图3）。

2.3 添加α2-f（56-57）：YS发酵酸奶的降血压作用

根据方法1.3.2制作添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶，按照方法1.3.3进行灌胃SHR，检测其血压变化，结果见图4。

图4 添加α2-f（56-57）：YS发酵乳对SHR血压的影响Fig.4 Effect of containing α2-f（56-57）：YS fermented milk on SHR systolic blood pressure（SBP）

与灌胃生理盐水相比，灌胃同等剂量普通发酵酸奶和添加α2-f（56-57）：YS的酸奶均匀降压效果，在灌胃后4 h，对SHR的尾动脉收缩压（SBP），普通酸奶可降低9.8mmHg，而添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶可降低32.5mmHg，在4 h后，血压开始逐渐恢复，8 h后基本恢复到初始值。因此，添加α2-f（56-57）：YS的发酵酸奶，具有很好的降高血压的效果。

3 讨论

ACE是一种多功能酶，在动物体内的升压系统肾素-血管紧张素系统（RAS）和降压系统激肽-激肽释放酶系统（KKS）中起着重要的调节作用，ACE对血压的作用见图5。

图5 血管紧张素转化酶抑制剂对血压的调节Fig.5 Angiotensin-converting enzyme inhibitors regulation on the blood pressure

血压的升高是由于该体系的平衡失调所致。在RAS系统中，当人或动物受激动因素的影响时，血浆中或组织中的肾素底物即血管紧张素原（angiotensinogen），在肾素的作用下，血管紧张素原C端失去亮氨酸（Leu），转化为血管紧张素Ⅰ（10肽）（angiotensin，AngⅠ）。在血浆和组织中，特别是在肺循环血管内皮表面存在ACE，Ang I在ACE的作用下，从其C末端去掉His-Leu生成血管紧张素Ⅱ（8肽），这是RAS系统中最强的血管收缩剂，能作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效果；与此相反在KKS中舒缓激肽是降压物质，它能舒张毛细血管增加其通透性，使血压下降[28-29]，ACE则使舒缓激肽失去C端的Phe-Arg而成为失活片段，引起血压升高。

因此，在从天然蛋白水解物中是否含有降血压的产物时，通常采用ACE活性抑制作用进行筛选。本文是在前期研究的基础上，获得具有ACE活性的酪蛋白水解产物[30-32]，进一步分离纯化，获得纯化的片段，经MS检测，确定其氨基酸序列为YS（酪氨酸-丝氨酸），经过与酪蛋白一级结构的比对，确定为α2-f（56-57）：YS。该片段经过体外检测，具有很好的ACE活性抑制作用（图1）。经过SHR的灌胃实验，发现在灌胃剂量在3 mg/kg mb～9 mg/kg mb具有很好的降血压效果（图2），且对正常wistar大鼠的血压无影响（图3）。按照动物实验的结果（9mg/kgmb），对于人的摄入量，按照60kg体重计算，每人每天喝100 mL酸奶，在酸奶中添加α2-f（56-57）：YS的量设计为60 mg/100 mL。添加该剂量的发酵酸奶，经灌胃SHR实验，与普通酸奶相比，具有很好的降高血压的作用（图4）。

4 结论

酪蛋白先经胃蛋白酶水解，再经胰蛋白酶水解，在水解产物中分离获得的片段α2-f（56-57）：YS，经体外和体内降压效果检测，对原发性高血压大鼠具有很好的降血压的功能，并对正常wistar大鼠的血压无影响。该片段应用于发酵酸奶中，可制备具有降压功能的酸奶。

[1]揭红波.浅谈心血管疾病的发病机理与预防[J].中外医疗,2011, (5):184

[2]陈绍行,沈卫峰.高血压治疗现状[J].国际心血管病杂志,2006, 33(2):67-69

[3]CHOBANIAN A V,BAKRLS G L,BLACK H R,et al.Seventh report of the joint national committee on prevention,detection,evaluation and treatment of high blood pressure[J].Hypertension,2003, 42(2):1206-1252

[4]Guidelines Committee.2003 European Society of Hypertension-European Society of Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension[J].Hypertension,2003,21(6):1011-1053

[5]中国高血压防治指南修订委员会.2004年中国高血压防治指南[J].中华心血管病杂志,2004,32(12):1060-1064

[6]张元宏.高血压病的药物治疗新进展[J].实用医技杂志,2007, 14(3):382-385

[7]张源淑,邹思湘.酪蛋白源生物活性肽[J].国外畜牧科技,1998,25 (4):33-36

[8]A M Michaelidou.Factors influencing nutritional and health profile of milk and milk products[J].Small Ruminant Research,2008,79: 42-50

[9]MATSUMOTO H,SHIMOKAWA Y,USHIDA Y,et al.New biological function of bovine α-lactalbumin:protective effect against ethanol-and stress-induced gastric mucosal injury in rats[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65(5):1104-1111

[10]MARUYAMA S,SUZUKI H.A peptide inhibitor of angiotensinⅠ-converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein[J].Agric Biol Chem,1982,46(5):1393-1394

[11]KOHMURA M,NIO N,ARIYOSHI Y.Inhibition of angiotensinⅠ-converting enzyme by synthetic peptides of human κ-casein[J].A－gricultural and Biological Chemistry,1990,54(3):825-836

[12]YAMAMOTO N.Antihypertensive peptides derived from food proteins[J].Biopolymers Peptide Science,1997,43(2):129-134

[13]姜瞻梅,田波,吴刚,等.酶解牛乳酪蛋白制备ACE抑制肽的研究[J].中国食品学报,2007,7(6):39-43

[14]顾瑞霞.乳与乳制品的生理功能特性[M].北京:中国轻工业出版社,2001:55-58

[15]李朝慧,罗永康,王全宇.乳清蛋白酶解制备ACE抑制肽的研究[J].中国乳品工业,2005,33(2):8-11

[16]FERREIRA I M P L V O,PINHO O,MOTA M V,et al.Preparation of ingredients containing an ACE-inhibitory peptide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates[J].International Dairy Journal, 2007,17(5):481-487

[17]COSTA E L D,GONTIJO J A D,NETTO F M.Effect of heat and enzymatic treatment on the antihypertensive activity of whey protein hydrolysates[J].International Dairy Journal,2007,17(6):632-640

[18]潘道东,郭宇星.瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽的条件优化[J].食品科学,2009,30(11):138-143

[19]ROKKA T,EEVA L.Release of bioactive peptides by enzymatic proteolysis of Lactobacillus GG fermented UHT milk[J].Milchwissenschaft,1997,52(12):675-677

[20]NAOYUKI Y,ATSUKO A,TOSHIAKI T.Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J].J Dairy Sci,1994,77:917-922

[21]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. BiochemPharmacol,1971,20:1637-1648

[22]潘道东.抗ACE活性之瑞士乳杆菌的筛选[J].食品科学,2007, 28(2):145-148

[23]王宇.乳酸菌发酵乳抑制血管紧张素转化酶活性的研究[D].无锡:江南大学,2008

[24]赵树平,陈永福,孙天松,等.瑞士乳杆菌ND01(L.helveticus ND01)发酵乳中ACE抑制活性和γ-氨基丁酸的研究[J].中国食品学报,2009,9(6):48-53

[25]申晓文,牟光庆.酪蛋白源ACE抑制肽的评价方法和研究进展[J].食品工业科技,2010,31(9):375-381

[26]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology,1971,20(7):1637-1648

[27]张燕,王红英,胡艳君,等.SHR大鼠血压尾套法测定影响因素探讨[J].西北药学杂志,2008,23(2):34-42

[28]张艳,胡志和.乳蛋白源ACE抑制肽的研究进展[J].食品科学, 2008,29(10):634-640

[29]张美莉.食品功能成分的制备及其应用[M].北京:中国轻工业出版社,2007:111-113

[30]杨铭,胡志和.酪蛋白双酶水解物ACE抑制肽的分离纯化[J].食品科学,2012,33(9):50-53

[31]王佳佳,胡志和.利用电子舌对富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的脱苦评价[J].食品科学,2013,34(4):212-216

[32]王佳佳,胡志和,蒋毅.富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及其功能性酸奶对SHR血压的影响[J].食品工业科技,2013,34(10): 345-356

Inhibition Effect of α2-（f56-57）：YS on ACE Activity and Its Application in Yoghourt

SUN Zhen-gang1，WU Wen-qi1，FENG Yong-qiang1，HU Zhi-he2，*，ZHAO Yong2
（1.Tianjin Haihe Dairy Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China；2.Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Objective of this research was to evaluate inhibition effect of α2-f（56-57）：YS，which from milk α2-casein，on ACE（angiotensin converting enzyme）activity，and its antihypertensive efficacy.And it was applied to produce yoghourt，which had antihypertensive efficacy.The inhibition effect of α2-f（56-57）：YS on ACE activity was evaluated using spectrophotometric method.The antihypertensive efficacy of α2-f（56-57）：YS and the yoghourt which contain α2-f（56-57）：YS was evaluated by gavage SHR（pontaneously hypertensive rat）in different dose.Results showed that α2-f（56-57）：YS had good inhibition effect on ACE activity in vitro，and its median inhibitory concentration（IC50）was 11.89 μg/mL.SHR was given α2-f（56-57）：YS in different dose（1，3，9 mg/kg mb）by gavage，after given 4 hour，the blood pressure of SHR was reduced 18.25，31.38 and 36.88 mm Hg，respectively，and it was return to the initial blood pressure values after given 8 hour.SHR was given the yoghourt of containing α2-f（56-57）：YS in 10 mL/kg mbby gavage，after given 4 h，its SBP was reduced 32.5 mm Hg，and after given 8 h，the SBP return to the initial value.Therefore，α2-f（56-57）：YS had antihypertensive efficacy，and applied it in yoghurt，could give the yoghourt antihypertensive efficacy.

ACE inhibitory peptides；α2-f（56-57）：YS；fermented yoghourt；antihypertensive efficacy

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.002

天津市科技支撑项目（14ZCZDNC00017）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（14JCZDJC34500）

孙振刚（1969—），男（汉），兽医师，学士，本科，研究方向：乳品加工。

*通信作者：胡志和（1962—），男，教授，硕士，研究方向：专用功能食品。

2014-12-08