HPV21亚型结果的实验室间比对体会

李 琼　伍 辉

（重庆市渝北区人民医院检验科，重庆 401120）

HPV21亚型结果的实验室间比对体会

李 琼伍 辉

（重庆市渝北区人民医院检验科，重庆 401120）

目的 通过对HPV21亚型实验结果的室间比对，评价实验室是否有开展此项目的力。方法 采用室间比对的方法对23例随机样本进行HPV分型检测。结果 该实验室结果与比对实验室结果存在分歧。结论 在操作HPV分型实验过程中，严格按操作说明进行，防止偶然误差出现。

HPV21；室间比对；偶然误差

子宫颈癌是女性最常见的癌症之一，仅次于乳腺癌。宫颈癌的发生与多种因素有关，如病毒感染、生活方式、环境及身体免疫状况等。大量研究表明，90%以上宫颈癌与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关［1］。宫颈癌是WHO建议在世界范围内开展筛查的肿瘤，而癌前病变早期筛查及及时治疗是预防子宫颈癌发生的有效措施［2-3］。目前筛查子宫颈癌前病变与子宫颈癌主要采用液基薄层细胞检测技术（TCT），此技术易受到多种因素的干扰而造成假阴性结果，以致造成漏诊，延误受检者病情。凯普HPV分型检测是中国宫颈癌防治工程唯一指定的产品（ISO13485：2003），目前是临床上应用较多的HPV分型检测方法，该方法以PCR-DNA扩增法为基础，应用导流杂交技术，可以同时检测21种HPV亚型病毒感染，该法联合TCT检测可提高宫颈癌及癌前病变的早期检出率［4-5］。为了验证该方法在该实验室的检测结果与其他实验室检测结果一致性，利用该实验室场地对凯普导流杂交法检测结果进行了验证。

1　资料与方法

1.1资料：①实验对象：该地区自愿受试者妇女样本，年龄30～55岁。②仪器与试剂。DNA提取试剂、杂交试剂与杂交仪：潮州凯普生物科技有限公司提供；DNA扩增仪：达安公司DA-7600。

1.2方法：①样本采集：按采集液基薄层细胞检测技术样本采集，由妇科医师刷取宫颈脱落细胞储存于HPV反向杂交法专用采样瓶中。②核酸提取：按凯普一步法核酸提取试剂说明书提取。③核酸PCR扩增：将PCR-Mix、Tad酶和DNA模板按要求混匀，体系26 μL/反应，DNA扩增在DA7600核酸扩增仪上进行，循环条件如下：95 ℃预杂交9 min，（95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）40个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃HOLD。④HPV导流杂交分型：操作按试剂说明书进行样本经DNA提取、PCR扩增后，与检测膜条进行杂交显色，出现蓝色斑点即为有相应的HPV亚型阳性。⑤验证标准：独立实验室反向杂交法实验结果；某三甲医院实验室的凯普导流杂交法实验结果。

2　结 果

2.1该实验室 23例随机标本中，检出4例HPV阳性，分别是16、18、33、53亚型，19例阴性；独立实验室与某三甲医院实验室23例标本中，1例阳性，即16亚型，22例阴性（表1）。

表1　不同实验室阳性实验结果

2.2该实验室2人分别再次对23例随机样本检测，结果与独立实验室和某三甲医院实验室实验结果一致（表1）。

3　讨 论

由于人们对医院的等级在意和健康意识提高，一次检测结果，尤其是阳性结果，不可能在一家医院检测后，就认同，他们会去信任度高的三甲医院实验室再次检测，且认为三甲医院实验室的实验结果可靠。按《医疗机构临床实验室管理办法》的要求与使患者对该实验室抱有更高的信任度，该实验室对HPV21亚型实验结果进行了室间比对，通过比对，确实发现了问题，不是仪器、试剂、方法的问题。而是人员问题，不按试剂盒操作说明书进行操作，凭经验操作，勿视实验条件，该室当时室温10 ℃，由于杂交液与B液试剂没预热至45 ℃，清洗次数随意减少，导致膜条背景不干净，出现假阳性。因此在实际操作中需重视每个环节，否则造成假阳性与假阴性结果，失去患者对结果的信任度。虽然凯普HPV分型检测方法比较成熟，应用的实验室比较多，但是在实际操作中也应注意一些环节。

3.1标本预处理：①合格标本检查：洗脱管完整，没有破损或漏液；标本不应是血性标本；标本保存得当，常温保存应＜12 h，4 ℃保存应＜7 d，-20 ℃保存应＜3个月或应低温运输等；宫颈脱落上皮细胞数镜检应＞15～20个/HP。②提取的DNA纯度（A260/280）需达到1.7～2.0，DNA浓度为≥3 ng/μL。③检测中设置阴性、阳性对照，控制实验过程中可能由操作引起的假阳性问题。

3.2杂交过程：①实验前准备，杂交检测试剂平衡至室温；杂交液使用前预热至45 ℃，如不预热至45 ℃，杂交不充分，可能造成假阴性；观察NBT/BCIP是否有紫色或蓝色沉淀出现，如出现，更换并准备新鲜NBT/BCIP溶液；观察溶液B中是否出现沉淀，如出现，加热至45 ℃溶解，然后平衡至室温，如果不预热45 ℃溶解，就不能完全洗脱膜上的显色剂NBT/BCIP，膜背景不干净，造成假阳性。②杂交仪前准备，仪器升温45 ℃；反应室充满蒸馏水，放好金属多孔板，排除多孔板上面水分后，关闭水泵，这一步是清洗反应室与多孔板，排空气体和检查多孔板与反应室是否是通的；杂交膜应放置在塑料膜对应孔上，如有多于孔应封闭，是为了确保杂交膜湿润且没有气泡。③杂交过程，PCR产物预热后立即冰水浴至少2 min，保证PCR产物单链结构；杂交液加入杂交孔内，预热45 ℃，再泵出是必须的，为保证孔是通的且无气泡；杂交后用45 ℃杂交液冲洗膜3次，保证未杂交的多余标本全部排出。④显色过程，A液、B液和蒸馏水清洗膜时，要彻底，保证多余酶标液与多余显色液全部清洗干净，使背景干净，避免引起假阳性。

3.3试剂保存：PCR Mix 、DNA Taq 阳性对照与阴性对照存于-20 ℃；杂交液、封阻液、酶标液、溶液A、溶液B、杂交膜和NBT/BCIP存于4 ℃。

总之，随着HPV导流杂交技术的普及，无论它多么成熟及完善，都应严格按操作步骤谨慎完成，不能随意改变仪器及试剂要求的温度及冲洗的时间和次数，无论哪个环节失误，最终都将导致实验结果不可靠，出现偶然误差，对受检者影响不好：假阳性造成受检者精神和经济负担，浪费TCT检查、阴道镜检查及病理活检等医疗资源；假阴性延误受检者病情，对实验室影响不好，失去信任度。

［1］曲守方，于婷，孙楠，等.人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒评价［J］.国际检验医学杂志，2015，36（2）:181-182.

［2］曹秀华.宫颈液基细胞学联合HPV-DNA检测在宫颈病变中的应用［J］.河北医学，2015，37（3）:414-415.

［3］颜卫山.人乳头瘤病毒分型联合液及细胞学检测在宫颈病变患者筛查中的应用［J］.中国民康医学，2015，27（2）:53-54.

［4］李建军，周海清.TCT联合HPV-DNA检测在宫颈癌前病变筛查中的价值［J］.基层医学论坛，检验与临床，2015，19（5）:662-663.

［5］韦娟.宫颈液基细胞学检查与高危型HPV检测用于宫颈癌前病变早期筛查对比分析［J］.吉林医学，2015，36（3）:489-490.

R737.33

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1671-8194（2015）18-0044-02