奶牛猝死症的流行及其病原菌的分离鉴定

周天德

1 流行病学

猝死症呈地区性散发，主要侵袭膘情较好的幼龄家畜。近年来，该病的发生出现了新特点，就是大龄家畜的发病和死亡率有增加的趋势。本病冬、春季节发病较多，该病的临床特点为病程短，不见任何症状，突然发病，从发病到死亡2小时左右，死前无明显体温变化，在上槽时才表现出采食量下降，精神沉郁，全身肌肉震颤，行走不稳，结膜发绀，呼吸急促，脉快而弱，流涎，随后倒地，四肢划动，迅速死亡。奶牛死亡后腹部迅速膨胀，口腔流出红色泡沫样液体，舌脱出于口外，肛门外翻，呈角弓反张状态。

2 剖检变化

死亡牛尸体外观营养状况良好，天然孔无异常，腹胀。剖检以全身实质器官和小肠出血为特征，心肌质地变软，心房及心室外膜有出血斑点；血液暗红；颌下、肩前、肠系膜淋巴结水肿，切面有斑点状出血；肺气肿，有出血症状；肝脏呈紫黑色，表面有出血斑点；胆囊、膀胱黏膜充血，有少量出血点；脾脏无明显变化；瘤胃、网胃、瓣胃黏膜有散在的针尖大的出血点，有的形成条状出血斑；皱胃充血、出血；小肠浆膜充血发红，黏膜呈现斑块状出血或弥漫性出血；肠内容物为暗红色粘稠液体。

3 材料与方法

病料：猝死牛的小肠内容物、肝等；培养基：血液琼脂培养基、肉肝汤培养基；试剂：革兰氏染液、生化试剂盒、 DNA聚合酶；仪器：PCR仪、离心机、电泳仪。

细菌分离培养：无菌采取猝死牛小肠内容物、肝，分离病原菌，接种于血液和肉汤培养基中，分别进行厌氧和需氧培养，37℃培养培养24～48小时后，观察生长情况，挑取单个菌落进行纯培养。

涂片染色镜检：挑取少量细菌做涂片，经革兰氏染色后油镜下观察细菌形态。

生化试验：将经过分离纯化的病原菌分别接种于明胶、硝酸盐、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢酶、甘露醇、淀粉、凝固血清和牛乳中，37℃培养24～48小时，观察结果。

应用PCR技术检测病原菌：染色体DNA的提取。将细菌在胰胨酵母精葡萄糖琼脂（TYG）培养基中37℃厌氧培养过夜，离心后，菌细胞重悬于含溶菌酶（2克/升）的TE中，37℃孵育1小时，然后加入二烷基硫酸钠（SDS）（终浓度为1%）、乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度50毫摩尔/升）和蛋白酶K（终浓度为150摩克/升），58℃水浴4小时，用等体积的饱和酚重复抽提3次，吸取上层水相，加1/5体积的乙酸铵（10摩尔/升）和2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀后置室温沉淀10分钟，用玻棒挑取线团状的染色体DNA沉淀至另一微量离心管中，加TE溶解DNA，4℃保存。

4 结果

细菌分离培养结果：病死牛小肠内容物、肝等病料在血液琼脂平板分离培养中未见细菌生长。经厌氧培养的血液琼脂平皿上生长出圆形、光滑、直径2～4毫米、边缘不整的灰黄色菌落，周围有明显的溶血环。厌氧肉肝汤中均匀浑浊并产生大量气体。

镜检结果：油镜下可见短粗的革兰氏阳性杆菌， 两端钝圆，单个或成双排列，具有明显的荚膜，无鞭毛，少数形成芽孢。初步怀疑为产气荚膜梭菌。

生化试验结果：分离菌能液化明胶；可还原硝酸盐；可分解葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖，产酸产气；过氧化氢酶试验阴性；不水解甘露醇；淀粉水解试验阴性；不液化凝固血清；牛乳试验呈暴烈发酵。

PCR产物电泳鉴定结果：经过30个循环后，扩增出了目的基因片段，从PCR产物的电泳结果图中可以看出，扩增出的片段长度与预计的长度相符，为420bp。

结合临床症状及剖检变化，综合判断认为，奶牛所发病为产气荚膜梭菌所致的奶牛猝死症。

5 讨论

根据流行病学调查、临床症状、剖检变化以及实验室检验，诊断为由产气荚膜梭菌引起的牛猝死症。

由于魏氏梭菌和腐败梭菌均可引起牛的猝死，在诊断时要注意2种细菌及其引起疾病的鉴别诊断要点。猝死症的发生可能与其他致病菌，如巴氏杆菌、链球菌等引起的混合感染有关。

从牛的猝死症防治来看，全面注射牛猝死症多价浓缩灭活菌苗的预防效果比較理想。坚持每年春、秋、冬季节在易发病区进行免疫接种，同时还应加强对养殖户的宣传教育，加强饲养管理。