广东男男性行为HIV-1感染者中耐药情况及基因型分布

于国龙1★ 秦冰2 鄢心革1 刁丽梅1 李杰1 周平平3 颜瑾1 李艳1 杨放1 林鹏1

·论著·

广东男男性行为HIV-1感染者中耐药情况及基因型分布

于国龙1★ 秦冰2 鄢心革1 刁丽梅1 李杰1 周平平3 颜瑾1 李艳1 杨放1 林鹏1

目的了解2013年在广东省新发现的男男性行为（man have sex with man，MSM）人类免疫缺陷病毒-I（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）感染者中基因型耐药情况及亚型分布。方法采用In-House方法，扩增HIV-l pol基因蛋白酶区（protease region，PR）基因全长和逆转录酶区（reverse transcriptase region，RT）基因部分片段，通过HIV-1耐药数据库，获得个体耐药突变位点、基因亚型及药物耐受情况。结果在203人中，HIV-1病毒载量拷贝数中值为4.27×104拷贝/mL，平均值拷贝数为9.37×104拷贝/mL；高度基因型耐药病例2人，占1.2％；中度耐药1人，占0.6％；低度耐药7人，占4.1％；潜在耐药26人，占15.4％。PR区未见主要耐药突变；RT区主要耐药突变有：K70R、M184V、T215IT、K219E、K103KN、V106I、E138EG、V179E/D；出现了针对核苷类逆转录酶抑制剂3TC及FTC的高度耐药1例，占0.6％；针对非核苷类逆转录酶抑制剂EFV及NVP高度耐药1例，占0.6％；亚型方面，主要以CRF01_AE及CRF_BC重组亚型为主，同时B亚型在MSM人群中占20.1％。结论广东省目前MSM感染者中HIV-1高度耐药毒株尚处于低流行，潜在耐药毒株可能已经在人群中传播；MSM人群中以CRF01_AE、CRF_BC重组亚型及B亚型毒株流行为主。

男男性行为；高效抗逆转录病毒治疗；HIV-1耐药

随着艾滋病病毒在我国的传播，目前传播途径已经从吸毒为主转为经性传播为主。广东省作为全国重要的流行地区之一，经性传播已成为人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）传播的主要方式，2013年经性传播比例达到84.9％，其中男男性传播比例从2008年的6.0％逐年上升到27.1％［1］。由于抗病毒治疗在我国的广泛开展，必然会出现耐药毒株在人群中的传播。对新近或新发人群的耐药监测，是了解耐药毒株在人群中传播的主要方式之一。既往调查显示，男男性行为者（man have sex with man，MSM），有可能出现更高的原发性耐药比例［2］。在我国的MSM中HIV原发耐药水平在4.9％，蛋白酶抑制剂耐药是主要的耐药形式，且存在着地区分布不均等因素［3］。对深圳市2010年的MSM人群调查显示，该人群中原发性耐药仍处于较低水平［4］，但对近年该人群的研究资料较少。本研究拟对2013年我省部分地区新发现的MSM感染者进行基因型耐药检测，了解该人群中原发性耐药情况。

1　材料方法

1.1目标人群

广东省2013年男男性行为人群新发感染评估项目中的新发现的HIV感染者203人。调查对象入选标准：年龄在18周岁及以上，平均年龄29.6岁；最近一年内与同性发生过口交或肛交性行为的男性；在知情同意基础上自愿接受问卷调查和HIV相关检测。

1.2病毒载量检测

运用瑞士ROCHe Cobas Amplicor全自动病毒载量检测仪及配套的Cobas Amplicor HIV-1Monitor Test检测试剂盒（瑞士，ROCHe公司），检测HIV-1病毒载量。样本进入仪器后，核酸提取及载量检测由载量仪自动完成。详细过程见试剂盒操作说明书。

1.3病毒RNA提取和目的基因扩增

所有检测到病毒载量的样本，用QIAamp Viral RNA Extraction Mini kit试剂盒（德国，Qiagen公司），在QIAGEN QIAcube自动核酸提取仪上提取HIV-1病毒RNA，-70℃保存待用。QIAGEN公司一步法RT-PCR试剂盒（德国，Qiagen公司）进行第一轮PCR扩增，总反应体系50 μL，含RTPCR Buffer Mg2+离子浓度2.5 mmol/L、dNTP 400 μmol/L、PRO-1 0.6 μmol/L、RT-20 0.6 μmol/L、酶混合物2 U、cDNA 5 μL；反应条件：50℃30 min，进行逆转录，95℃15min灭活逆转录酶；94℃变性3 min后进行PCR扩增：94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min 30 s，共35个循环。取第一轮PCR产物5 μL作为反应模板，运用QIAGEN Taq PCR Master Mix试剂盒，进行第二轮PCR扩增，反应体系如下：总体系50 μL，包含TaqMix 25 μL、MAW-26 0.4 μmol/L、RT-22 0.4 μmol/L及首轮PCR产物5 μL；反应条件为：94℃变性3 min后进行PCR扩增；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35个循环。所有反应均采用国家疾控中心推荐的In-house方法使用的扩增及测序引物，见表1。

表1　基因型耐药检测使用引物Table 1The primers for detected the HIV-1 genotypic resistance

1.4基因测序及基因型耐药分析

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，与目的扩增片段大小一致，将扩增产物送北京诺赛基因有限公司测序；测定后的序列用sequencer5.0软件进行拼接、编辑、校正。将整理后的序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database［5］行基因型耐药分析，获得耐药突变位点、耐药类型及毒株的亚型结果。

2　结果

2.1病毒载量检测结果

在203份样本中，18份样本感染者因为样本量不够未进行病毒载量检测，但进行了耐药基因型检测，185份进行病毒载量检测。其中病毒载量拷贝数小于1×103/mL的样本占3.2％（6/185）；病毒载量拷贝数在1×103～1×104/mL的样本占8.6％（16/185）；病毒载量拷贝数在1×104～1× 105/mL的样本占64.3％（119/185）；拷贝数为1× 105～1×106/mL的样本占23.2％（43/185）；病毒载量拷贝数大于1×106/mL的样本占0.5％（1/ 185）。病毒载量检测中值：拷贝数为4.27×104/ mL，平均值：拷贝数为9.36×104/mL。

2.2PCR扩增及基因型耐药结果

有效扩增并成功测序进行基因型耐药分析169人，扩增成功率为89.8％（169/203）；总体样本中高度耐药2例，占1.2％；中度耐药1例，占0.6％；低度耐药7例，占4.1％；潜在耐药26例，占15.5％；其中蛋白酶抑制剂（protease inhibitors，PIs）潜在耐药2人，占1.2％；PIs低度耐药病例3人，占1.8％；PIs区未见中度及高度耐药病例，核苷类逆转录酶抑制剂（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）潜在及低度耐药各3人，分别占1.8％；高度及中度耐药各1人，各占0.59％；非核苷类逆转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）潜在耐药21人，占12.4％，低度耐药2人，占1.2％，未见中度耐药，高度耐药1例占0.6％。不同类型药物的耐药程度及比例见表2。

表2　不同类型药物耐药程度及所占比例（检测人数n=169）Table 2The percent of HIV-1 genotypic resistance in MSM（total number n=169）

2.3常见耐药突变耐药药物类型

核苷类逆转录酶编码区导致高度耐药突变位点为M184MV、T215IT，各占0.59％（1/169）；非核苷类逆转录酶抑制剂导致高度耐药突变K103KN占0.59％。在蛋白酶编码区，尚未出现高度耐药突变，其它类型突变及突变百分比详见表3。在耐药药物类型方面，针对核苷类逆转录酶抑制剂拉米夫定（lamivudine，3TC）及恩曲他滨（emtricitabine，FTC）的高度耐药1例，针对非核苷类逆转录酶抑制剂依法韦仑（efavirenz，EFV），奈韦拉平（nevirapine，NVP）高度耐药1例，未见对其他类型药物的高度耐药，针对出现的其它不同类型药物的中度及潜在耐药结果见表4。

2.4HIV-1亚型比例

本次所有测序成功样本中，亚型结果均根据斯坦福耐药数据库中直接给出的基因亚型来进行亚型分类，由于该亚型分类仅仅能将BC亚型分出，不能区分07BC及08BC亚型，所以本研究中仅给出CRF_BC亚型的比例。其中，CRF_01AE亚型78例，占46.2％（78/169）；B亚型34例，占20.1％（34/169），CRF_BC亚型56例，占33.2％（56/169）；其它1例，占0.6％（1/169）。

表3　常见耐药突变类型及比例Table 3The genotype mutation and percent in MSM populations

表4　针对不同类型药物耐药数及耐药水平Table 4The drug resistance level and number of patients with drug resistance

3　讨论

HIV-1病毒在男男性行为人群中目前已经出现高流行的趋势，我国的哨点监测发现，该人群的发病率已经处于首位，高于其它高危人群。既往我国MSM人群研究资料报道，HIV-1原发耐药在4.9％左右，蛋白酶抑制区的耐药发生率比较高［3］，广东地区MSM人群中是否也存在这一现象，近年的相关研究资料较少。既往的研究资料表明，广东地区MSM人群中的耐药发生率2％～3％之间［4，6］，低于全国的研究报道，逆转录酶区（reverse transcriptase region，RT）区耐药检出率仅2.79％，蛋白酶区（protease region，PR）的耐药程度更低［6］。这些研究资料的差异可能是由于时间及人群选择的差异造成。随着HIV-1的疫情在MSM人群中的快速传播，及时了解广东地区MSM人群中的HIV-1耐药流行情况，亚型及药物耐药类型，对于地区HIV-1治疗及防控策略的制定与调整具有重要意义。

本研究通过对广东省2013年新报告的MSM中HIV-1感染者的基因型耐药分析发现，目前在该地区的MSM感染者中，高度耐药仍然处于低流行水平。本研究中出现的两例高度耐药分别为针对核苷类逆转录酶抑制剂3TC及FTC及非核苷类逆转录酶抑制剂EFV和NVP的高度耐药。导致核苷类逆转录酶抑制剂高度耐药的基因突变位点为M184MV、T215IT，而导致非核苷类逆转录酶抑制剂高度耐药的基因突变位点为K103KN，与之前针对广东省长期治疗病人中出现的高度耐药类型及突变位点一致［7］。针对这一结果的可能解释之一，这些原发性的毒株可能来源于长期治疗人群中的耐药毒株。在针对药物耐药类型方面，HIV-1蛋白酶区的耐药突变仍处于较低水平，不同于之前的研究报道［3］，与本省内深圳地区基本相同［6］。在非核苷类逆转录酶抑制剂方面，本研究人群中的潜在耐药明显增高，达到了12.4％（表2）。虽然高度耐药及低度耐药在MSM人群中仍然处于低流行水平，但该人群中总体潜在耐药比例达到了15.4％（表2），已经远超2012年深圳地区［6］及我国其他地区MSM人群中报道的耐药水平［4，6，8-9］。如果按照耐药警戒线检测的标准判定，当某一地区HIV-1耐药水平大于15％，说明该地区已近处于耐药的高流行水平。按照此标准判定，在该人群中，潜在的耐药突变毒株可能已经开始在人群中出现传播。由于目前MSM人群HIV-1发病率高居首位［1］，其人群性活跃程度较高，一旦出现耐药毒株，容易出现在人群中的快速传播，所以在MSM人群中进行耐药常规的监测及检测已经非常必要。

在基因亚型方面，MSM人群中HIV-1流行毒株主要以CRF_01AE亚型为主，占46.2％，为MSM中的主要流行亚型；其次为BC重组亚型，占33％；该MSM人群中处于第三位的流行毒株为B亚型，占20.1％，与我国其它地区MSM中流行亚型所占比例大致相同［10-12］。但与广东深圳地区2008-2009年发现的MSM HIV-1感染者中所报道的B亚型比例（47.8％）差异较大［6］。本实验室正在进行的对广东省2013年新发现的HIV-1感染者进行分子流行病学研究发现，目前广东省新发现的HIV-1感染者中，CRF01_AE占53.1％、CRF07_BC占26.0％和CRF08_BC占8.6％，是广东省主要流行的3种亚型，B亚型仅仅占1.2％。这也说明B亚型在MSM人群中不同于普通人群及吸毒人群［13］，是主要的流行毒株之一。造成这种毒株差异的原因之一可能为，MSM人群中性活跃程度较高，B亚型毒株在该人群中所占的比例短期内应不会明显下降。

综上所述，广东省目前MSM感染者中HIV-1高度耐药毒株尚处于低流行，潜在耐药毒株可能已经在人群中传播；MSM人群中以CRF01_AE、CRF_BC重组亚型及B亚型毒株流行为主。

［1］广东省卫生和计划生育委员会.2014年艾滋病工作情况通报［EB/OL］.http：//www.gdwst.gov.cn/a/zhgg/ 2014120112585.html，2014-12-01/2015-03-06.

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Investigation of HIV-1 drug resistance and gene subtype prevalence in man have sex with man in Guangdong province

YU Guolong1，QIN Bing2，YAN Xinge1，DIAO Limei1，LI Jie1，ZHOU Pingping3，YAN Jin1，LI Yan1，YANG Fang1，LIN Peng1
（1.Institute of AIDS Control and Prevention，Guangdong Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou，Guangdong，China，510300；2.The Preventive Drugs Department of Guangdong Provincial Institute of Biological Products and Drugs，Guangzhou，Guangdong，China，510440；3.The Center Lab of Guangdong Provincial Institute of Public Health，Guangzhou，Guangdong，China，511430）

ObjectiveTo estimate the drug resistance and subtype distribution among human immunodeficiency virus 1（HIV-1）-infecters（man have sex with man，MSM）in Guangdong province in 2013. MethodsThe full length of HIV-1 protease gene and part of reverse transcriptase gene were amplified with the In-house method.The obtained sequences were blasted with the stanford HIV-1 drug resistance database to get the drug resistance mutations，gene subtypes and drug resistance.ResultsIn 203 patients，the median viral load was 4.27×104copies/mL，and the average value was 9.36×104copies/mL.It was showed that 2individuals（1.2％）were highly resistant，1 individual（0.6％）was intermediate resistant，7 individuals（4.1％）were with low level of resistance，and 26 individuals（15.4％）were with potential low level of resistance.No major resistance mutation was found in protease region（PR）.The major drug resistance mutations in reverse transcriptase region（RT）were K70R，M184V，T215IT，K219E，K103KN，V106I，E138EG and V179E/D.One high drug resistance to 3TC and FTC was found in nucleoside reverse transcriptase inhibitor（NRTI），and one high drug resistance to NVP and EFV was found in non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor（NNRTI）.The high drug resistance in NRTI and NNRTI was 0.6％and 0.6％，respectively.The CRF_01AE was the main subtype among the MSM population，which was followed by CRF_BC，and the proportion of B subtype in MSM population was 20.1％.ConclusionAlthough the HIV-1 strains with high resistance level are now prevailing at a low level，the potential resistance viral strains might have been prevailing among MSM population.And the CRF01_AE，CRF_BC and B subtype are the prevalent HIV-1 subtypes among the MSM population.

Man have sex with man；Highly active antiretroviral therapy；HIV-1 drug resistance

·综述·

“十二五”重大科技专项（2012ZX10004902）；广东省医学科研基金（WSTJJ2014A088）

1.广东省疾病预防控制中心艾滋病预防控制所，广东，广州510300 2.广东省生物制品与药物研究所预防药物研究室，广东，广州510440 3.广东省公共卫生研究院中心实验室，广东，广州511430

于国龙，E-mail：guolongy@126.com