Xpert MTB/RIF技术在基层实验室结核病诊断中的应用研究

王怡心1 陈雄豪2★ 林惠玲1 蒋英1

Xpert MTB/RIF技术在基层实验室结核病诊断中的应用研究

王怡心1 陈雄豪2★ 林惠玲1 蒋英1

目的评估结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert MTB/ RIF）在基层实验室结核病诊断中的可行性与准确性。方法对1 042例来自区级结核病防治单位门诊初诊者的痰液样品，分别进行涂片镜检、固体培养、传统比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF检测，分析比较Xpert MTB/RIF法和传统方法检测痰标本中的Mtb及其耐药性的敏感度、特异度及检测耗时。结果以固体培养试验结果作为金标准，Xpert Mtb/RIF方法检测痰标本Mtb的敏感度和特异度分别93.7％（655/699）和87.5％（300/343）。以传统比例法药敏试验结果为金标准，Xpert Mtb/RIF方法检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为86.8％（79/91）和95.3％（531/557）。Xpert MTB/RIF系统平均检测耗时为2 h。结论Xpert Mtb/RIF检测操作简单、快速，检测敏感度高于涂片镜检法，与固体培养法有极好的一致性，同时该方法可以诊断患者是否对利福平耐药，在我国县（区）级实验室具有非常好的应用前景。

结核分支杆菌；利福平；Gene Xpert检测；敏感度与特异度

在当今社会结核病仍然是一个重要的公共卫生问题，据报道世界上约有三分之一的人口感染结核杆菌，其中每年新发病人约有900万，死亡人数高达300万［1］。随着耐多药的病例日益增多，这将造成结核病更加疯狂的流行。而在我国结核疫情十分严峻，具有感染人数多、死亡人数多、耐药人数多和传染性肺结核患病率高的特点。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）强调遏制结核病的主要方法是普及高效和以人为本的检测诊断技术，而快速检测和可靠的耐药性测试是先决条件［2］。然而，世界的许多地区，结核病诊断仍然依赖于不敏感、缺乏标准化的抗酸杆菌染色法和耗时很长且要求标本含有存活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）才能培养。至于药敏试验，目前WHO已经推荐了常用的固体和液体培养基的一线和二线抗结核药物药敏试验方法所需要的药物临界浓度和临界比例［3］，但固体培养和液体培养方法分别需要4 w和2 w才能报告药敏结果。基于上述提到的现有实验室诊断方法的局限性，随着结核病实验室诊断技术的不断发展，新型的分子检测方法即结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（xpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，Xpert MTB/ RIF）已经受到广泛关注。目前WHO十分认可Xpert MTB/RIF，并认为“这种检测方法可能对结核病的治疗和控制带来革命性变化，是全球结核病诊断和治疗方面的一个重要里程碑”。在经过了18个月的严格评估，2010年12月WHO正式推荐使用Xpert MTB/RIF技术作为一种全新的结核病快速检测新方法用于结核病及利福平耐药的检测。为了评估该技术在基层实验室结核病诊断中的可行性与准确性，本研究拟对1 042例疑似结核病患者的痰标本分别采用传统方法和Xpert MTB/ RIF法进行检测，通过比对检测的敏感度、特异度及检测耗时评价Xpert MTB/RIF法在基层实验室的应用前景。

1　方法

1.1实验对象

1 042份痰标本来自2012年10月至2014年12月在深圳市6个区级慢性病防治院就诊的疑似结核病患者。

1.2研究方法

所有标本分别进行涂片镜检、罗氏固体培养、比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF检测。

1.2.1抗酸染色

按照中国结核病防治规划《痰涂片镜榆标准化操作及质量保证手册》中要求进行操作。

1.2.2分离培养及药敏试验

采用4％氢氧化钠处理法，用无菌操作的方法将标本接种于改良罗氏培养基的斜面上，37℃分别培养3 d和7 d后各观察1次。此后，每周观察1次生长情况并记录，培养至阳性结果出现，或60天后无生长判断为阴性结果。一旦培养基上出现菌落，即进行抗酸染色涂片确认是抗酸杆菌，然后进行生化实验菌种鉴定及药敏，培养阳性标本参照《结核病细菌学检验规程》［4］。

1.2.3Xpert MTB/RIF检测

将标本与含氢氧化钠及异丙醇的处理液常规按1∶2比例混合（若痰中含脓球则为1∶3），震荡，室温静置15 min，再将混合液转移至一次性多室塑料反应盒中，置于Gene Xpert检测系统（美国Cepheid公司）进行全自动检测，约2 h即可在检测软件窗口直接读取结果。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0对Xpert MTB/RIF及涂片法与固体培养法的检测结果进行一致性检验（Kappa检验），K＜0.4为一致性差，在0.40～0.75之间为一致性好，K≥0.75为一致性极好。涂片法与Xpert MTB/RIF的敏感度、特异度比较及Xpert MTB/RIF与比例法检测利福平耐药率的比较使用χ2检验，P＜0.05有统计学差异。

2　结果

2.1Xpert MTB/RIF对痰标本Mtb的检测结果

表1中显示，以固体培养结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测1 042例样本中Mtb的敏感度为93.7％（655/699）、特异度为87.5％（300/343），总体符合率为91.7％；涂片法检测结果的敏感度为84.3％（589/699）、特异度为94.5％（324/343），总体符合率为87.6％。对Xpert MTB/RIF和固体培养进行Kappa检验，K=0.811，两者具有极好的一致性。对涂片法和固体培养进行Kappa检验，K= 0.737，两者具有好的一致性。但以固体培养结果为金标准，涂片法与Xpert MTB/RIF的敏感度、特异度比较均有统计学差异（χ2值分别为31.787与10.213，相对应的P值分别为0.000与0.001），Xpert MTB/RIF法敏感度优于涂片法，涂片度的特异性优于Xpert MTB/RIF法。

表1　以固体培养试验为金标准，Xpert MTB/RIF检测Mtb分析Table 1Mtb analysis by Xpert MTB/RIF based on the solid culture result

2.2Xpert MTB/RIF检测对利福平耐药分析

表2结果中，以比例法药敏结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测648例利福平耐药结果的敏感度为86.8％（79/91）、特异度为95.3％（531/557），Xpert MTB/RIF与比例法对利福平耐药性的检出率无统计学差异，χ2值为1.178，P=0.278＞0.05。

表2　以比例法药敏试验金标准，Xpert MTB/RIF检测对利福平耐药分析Table 2Rifampin resistance analysis of Xpert MTB/RIF based on the conventional drug susceptibility test result

2.3检测时间

本次实验全部完成的时间仅用2 h，比目前大多数的肺结核实验室诊断技术有很大的时间优势。

3　讨论

Gene Xpert实时荧光定量核酸扩增检测技术采用的是巢式实时荧光聚合酶链反应体外诊断方法，它整合了传统PCR检测所需的样品的制备，核酸的提取、扩增，目标序列的检测等全部步骤。其采用了独立的一次性试剂盒，并由系统自动完成，相比传统的PCR方法，具有操作简便、生物安全性高、检测过程不易受干扰等优点。Xpert MTB/RIF检测试剂盒能检测样本中的结核杆菌和与利福平耐药相关的rpoB基因，能对耐多药患者进行初筛，此外它有很高的敏感性和特异性，检验周期也非常短。正是基于上述的巨大优势，WHO将这一检测方法纳入其工作规划的建议和指导，并且发布各国的推荐和执行手册，推荐将此新技术合并到各国的结核病防治计划，并强烈推荐此方法应作为低中收入国家对耐药性结核病和结核病/艾滋病联合感染的首选检测方法。因痰液行抗酸染色阳性率较低，且结核病痰样本结核菌数目需＞5 000条/mL才能得到阳性结果［5］。涂片法亦有其它缺点，如抗酸杆菌包括结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌，即使抗酸染色阳性亦不能说明是否为结核分枝杆菌感染。本次实验中的Xpert MTB/RIF法对结核杆菌检测的敏感度为93.7％，明显优于涂片法的84.3％，与固体培养法进行比较，两者具有极好的一致性，同时在110例涂片法阴性而固体培养法为阳性样品中，Xpert MTB/RIF检测结果阳性80例，阴性30例，由此可见该方法可作为抗酸染色镜检的后续检测手段［6-9］。

本实验在区级结核病防治机构采用临床就诊的疑似结核病患者的痰标本，通过Xpert MTB/ RIF检测其Mtb及利福平耐药性的敏感度、特异度及检测耗时。结果显示，Mtb的敏感度到达93.7％、特异度为87.5％，其中，敏感度与2010年在南美洲、非洲和亚洲多个国家级结核病实验室共同对1 843例患者进行Xpert MTB/RIF检测报道的结果96.0％相近，而特异度略低于国外报道的98.6％［10］，特异度略低于国外相关报道，可能是由于我国是以传统固体培养试验作为金标准，而国外多以敏感性较高的液体培养作为金标准［11］的原因所导致。同时近年来国内有研究发现，针对不同的检测标本Gene Xpert的敏感度和特异度显示出不同的差异。李辉等［12］提出Xpert MTB/RIF检测Mtb对于涂片阳性标本检测的敏感度高，对于临床诊断为肺结核标本的敏感度较低，而特异度则相反，这说明用Xpert MTB/RIF检测方法在检测不同标本时，敏感度与特异度之间需要需求平衡，但对于不同标本Gene Xpert都显示出很高的特异度。

目前，利福平耐药作为耐多药的主要参考标准，以比例法药敏试验为金标准，Xpert MTB/RIF检测Mtb对利福平耐药性检测的敏感度和特异度分别为86.8％和95.3％，敏感度也略低于国外相关报道的97.6％［10］，张治国等［11］提出将比例法药敏试验和差异菌株测序结果联合作为金标准，其敏感度和特异度都能得到提升。耐利福平分支杆菌的耐药基因虽然多集中在81 bp的核心突变区，但在我国不同的地域人群中利福平耐药菌株的rpoB基因的突变频率不尽相同［13］，但Gene Xpert是通过检测rpoB基因片段核心突变区来诊断耐利福平结核病。有研究通过比较我国不同地域标本，结果显示Mtb对利福平耐药具有较高的敏感度和特异度以及与传统金标准药敏试验较高的一致性［12］。这个就进一步显示出Xpert MTB/RIF检测方法在我国具有较强的实用性。

Xpert MTB/RIF的检测平均耗时为2小时，而痰涂片要1天，液体培养需要半个月、固体培养要超过1个月才能得出结果，而对利福平的药敏检则需要超过2个月的时间。这其中时间成本的差别是显而易见的。

Xpert MTB/RIF也存在某些自身的问题及局限性，如本次实验就有51例无利福平耐药结果。这可能除了跟Gene Xpert仪器的注射器和探测信号有关，更大程度可能是与留取的标本质量有关，如标本不足1mL、标本为唾液、标本为带有血液或食物残渣的不合格样本［14］，这些都有可能导致测试失败。其它不足之处还有：Xpert MTB/RIF在儿童结核病诊断方面的实验结果并不乐观［15-16］；该技术不能检测异烟肼等耐药情况；对肺外标本有关的检测证据有限；试剂盒成本较高等。而且到目前为止，全球尚未发表有关该系统对结核病传播控制的效果研究报告，而且绝大部分研究都是在参比实验室完成，缺乏在门诊或县区级实验室使用效果的详细数据［17］。但是Xpert MTB/RIF作为一种快速、直接可靠、高敏感度、特异度地检测出结核病患者及是否对利福平耐药的新诊断技术，可以帮助临床医生发现越来越多的常规检测不易发现的结核病人，以及比常规方法预先发现耐多药结核病。而且目前Gene Xpert仪器除了用于普通结核病诊断外，也已经开始用于检测白血病、肠病毒和链球菌等多种病原微生物，但是由于设备价格和使用成本比较高，短期而言要大范围推广会有一定的困难。从2013年起中国全球基金给全国几十家基层结核病防治机构陆续配发了Gene Xpert检测系统并在全国范围内举行了多期培训班，这就大大促进了Gene Xpert检测系统的推广和使用。WHO建议加快Xpert MTB/RIF检测技术作为一种全新的结核病快速诊断新工具的使用。由于该仪器仅需要两个独立区域，这种较低的硬件设施要求使其未来可以在更多的县、区级基层实验室开展，有助于结核病患者较早的得到准确的诊断、充分的治疗和患者管理［18］。本实验也在某种程度上再次证明该方法在我国基层实验室对于结核病诊断及利福平耐药患者的筛查方面具有一定的意义和前景。

［1］World Health Organization.Global tuberculosis control：epidemiology，strategy，financing［R］.World Health Organization Press，2010.

［2］Raviglione MC.The global plan to stop TB，2006-2015［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2006，10（3）：238-239.

［3］World health organization.Policy guidance on drugsusceptibility testing（DST）of second line antituberculosis drugs［G］.World Health Organization Press，2008.

［4］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程［M］.北京：中国教育文化出版，2006：17-18.

［5］徐大叶.某结核病定点医院痰涂片阳性率低的调查及应对措施［J］.医学动物防制杂志，2014，30（10）：1177-1178.

［6］World Health Organization.Policy statement：automated real-timenucleicacidamplificationtechnologyfor rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampiein resistance：Xpert MTB/RIF System［R］.World Health Organization Press，2011.［7］World Health Organization.Road for rolling out Xpert MTB/RIF for rapid diagnosis of TB and MDR-TB［R］. World Health Organization Press，2010.

［8］Abu-Raddad LJ，Sabatelli L，Achterberg JT，et al.Epidemiological benefits of more efective tuberculosis vaccines，drugs，and diagnostics［J］.Proc Nail Acad Sci USA，2009，106（33）：13980-13985.

［9］World Health Organization.Tuberculosis diagnostics automated DNA test.WHO endorsement and recommendations［R］.World Health Organization Press，2010.

［10］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al.Rapid moledular detection of tuberculosis and rifampin resistance［J］.N Engl Med，2010，263（9）：1005-1015.

［11］张治国，欧喜超，孙倩，等.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究［J］.中国防痨杂志，2013，35（1）：13-16.

［12］李辉，谭耀驹，李洪敏，等.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术的诊断效果的对比研究［J］.中国防痨杂志，2014，36（6）：472-476.

［13］李辉，马晓光，石洁，等.线性探针法MtbDRplus用于涂阳肺结核的耐多药检测研究［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（2）：380-383，386.

［14］Durovni B，Saraceni V，Cordeiro M，et al.Operational lessons drawn from pilot implementation of Xpert MTB/ Rif in Brazil［J］.Bull World Health Organ，2014，92（8）：613-617.

［15］Nicol MP，Workman L，Isaacs W，et al.A descriptive study of the accuracy of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of pulmonary tuberculosis in hospitalized chil dren in a high HIV prevalence area［J］.Lancet Infect Dis，2011，11（11）：819-824.

［16］Hatherill M，Hanslo M，Hawkridge T，et al.Structured approaches for the screening and diagnosis of childhood tuberculosis in a high prevalence region of South Africa［J］.Bull World Health Organization，2010，88（4）：312-320.

［17］郑志刚.Xpert MTB/RIF检测结核杆菌和利福平耐药的研究及应用进展［J］.应用预防医学，2014，20（2）：120-123.

［18］夏辉，赵雁林.Xpert MTB/RIF在我国的应用前景［J］.实用医学杂志，2013，29（23）：3799-3800.

Application research of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosisin in the primary laboratory

WANG Yixin1，CHEN Xionghao2★，LIN Huiling1，JIANG Ying1
（1.Department of Laboratory Medicine，Futian District Hospital for Prevention and Treatment of Chronic Diseases，Shenzhen，Guangdong，China，518048；2.Department of Laboratory Medicine，Futian District Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518048）

ObjectiveTo investigate the feasibility and accuracy of Xpert MTB/RIF assay in the diagnosis of tuberculosis in primary laboratory.Methods1 042 sputum samples from patients with clinically suspected tuberculosis from clinics in Shenzhen were collected.And the sensitivity，specificity and test time of different detection methods，including smear test，solid culture，traditional proportion method drug susceptibility test，and Xpert MTB/RIF test，in the detection rate of mycobacterium tuberculosis（MTB）and rifampicin resistance，were analyzed.ResultsCompared with the results of the solid culture test，the sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF for MTB respectively were 93.7％（655/699）and 87.5％（300/343）.Compared with the results of traditional proportion method drug susceptibility test，the sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF for in the detection rate of rifampicin resistance respectively were 86.8％（79/91）and 95.3％（531/557），and the mean of test time of Xpert MTB/RIF was 2.1 hours（range，1.8-2.6 hours）.Conclusion

Mycobacterium tuberculosis；Rifampin；Gene Xpert test；Sensitivity and specificity

·综述·

1.深圳市福田区慢性病防治院检验科，广东，深圳518048 2.深圳市福田区妇幼保健院检验科，广东，深圳518048

陈雄豪，E-mail：raky1111@163.com

Compared with other test methods，Xpert MTB/RIF test significantly improved the diagnositic sensitivity and specificity for MTB.Xpert MTB/RIF test can be used to detect rifampicin resistance.And Xpert MTB/RIF test will provide a specific method for the early diagnosis of tuberculosis.