细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白的生物信息学分析

符瑞佳 吕刚 尹飞飞 梁培★

·论著·

细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白的生物信息学分析

符瑞佳 吕刚 尹飞飞 梁培★

目的应用生物信息学技术对细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）14-3-3zeta蛋白的结构和功能进行预测和分析，为进一步的实验研究提供依据。方法利用美国国家生物技术信息中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY，http：// expasy.org/）提供的各种有关基因和蛋白序列、结构信息分析的工具，并结合其它生物信息学分析软件，对该蛋白质的结构和功能进行预测和分析。结果该基因全长为771 bp，编码256个氨基酸，其编码的蛋白相对分子量理论预测值和等电点分别是29.4 kDa和5.04。预测该蛋白无信号肽和跨膜区，二级结构含8个α-螺旋和12个β-折叠股，氨基酸序列中有9个潜在抗原表位。结论初步认识了细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白的基本特征，为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

细粒棘球绦虫；14-3-3zeta蛋白；生物信息学；结构；功能

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）是一种重要的人兽共患的寄生虫，其成虫寄生于犬科食肉动物，幼虫能够寄生于人及多种食草动物，引起一种严重的囊型棘球蚴病（Cystic echinococcosis），又称为囊型包虫病。在人与动物之间互相传播，人因误食虫卵而感染，其包虫囊肿在肝脏内最为多见，偶尔侵袭肺部、脑部、骨骼等其它器官［1-2］。在我国西部和北部广大的农牧地区，生活水平落后，群众防范意识较差，导致该病的感染十分严重［3］。同时，近年来全国各地养家犬数量的增加，可能会导致棘球蚴病的向多地蔓延，严重影响了人民的生命健康，且对当地的畜牧业造成很大的经济损失。

随着分子生物学技术的不断发展，许多国内外的学者近年来在棘球蚴病的预防和治疗方面取得了一定的进展，但依然没有达到理想的效果［4-7］。因此，有必要寻找新的候选基因，并对其生物学相关功能进行鉴定，为棘球蚴病的防治奠定基础。本研究选取了细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白，采用生物信息学技术对其结构和功能进行预测和分析，为进一步的实验研究提供议论依据，判定该蛋白在细粒棘球蚴病的防治和诊断过程中是否存在一定的价值。

1　材料

细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库由上海联合基因公司构建，大规模测序得到多个表达序列标签（EST）。编码细粒棘球绦虫14-3-3zeta的核酸序列从该文库中获取，GenBank中的登录号为EUB61917.7。

2　方法

通过NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）BLASTx（http：//expasy.org/）程序，将基因序列编码的氨基酸序列与GeneBank中的蛋白质序列进行对比，推测该基因的功能，判断是否全长基因。利用ORF Finder查找其完整的编码序列，然后再用Translation程序推导并输出其氨基酸序列。编码的氨基酸序列与其他物种的序列利用Vector NTI suite 8.0进行多序列比对和利用Tree-View software分析进化树。通过蛋白分析系统Expasy（http：//www.expasy.org/）所提供的蛋白组学和序列在线分析工具，如Protparam进行该蛋白理化性质的预测；MotifScan对理论蛋白质进行功能位点预测；TargetP分析亚细胞定位序列；PredictProtein预测氨基酸序列的跨膜区和拓扑结构以及二级结构、分子的亲水性、溶液中的分子形态等；BepiPred进行B细胞表位预测；Swiss-modle分析蛋白质的三维结构。

3　结果

3.1基因的识别和鉴定

利用Blastx对该基因进行核苷酸水平的相似性分析，发现了文库中有一条相似度为100％的序列，属于细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白序列。该基因全长为771 bp，开放阅读框为35 bp～805 bp，编码256个氨基酸，见图1。

图1　细粒棘球绦虫14-3-3zeta的ORF编码及氨基酸序列Figure 1ORF sequence of Eg14-3-3zeta and amino acid sequence

细粒棘球绦虫14-3-3zeta功能域的分析结果，显示有多个多肽结合位点和多聚体结合位点存在，见图2。

图2　细粒棘球绦虫14-3-3zeta功能域分析Figure 2Analysis of functional domain of Eg14-3-3zeta

3.2蛋白质的理化性质

预测该蛋白质的理论等电点（PI）为5.04，分子量为29.4 kDa。当二硫键全部打开的时候，280 nm处摩尔消光系数为34 380 U·M-1·cm-1，0.1％浓度的Abs为1.168；当二硫键全部为二硫键时，280 nm处摩尔消光系数为34 755 U·M-1·cm-1，0.1％浓度的Abs为1.181。当蛋白序列N端的一个氨基酸为蛋氨酸时，在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30 h，在酵母和大肠埃希杆菌中体内表达的半衰期分别大于20 h和10 h。在液体环境中的不稳定指数为50.32，高于阈值40，在溶液中性质不稳定。其疏水指数为76.60，总的亲水性为-0.675，蛋白质的总体呈疏水性。

3.3蛋白质亚细胞定位、信号肽、跨膜结构预测

该蛋白存在于细胞内，没有发现信号肽系列，也没有发现线粒体、叶绿素等定位序列，为非分泌性蛋白。同时，该蛋白不存在跨膜结构。

3.4B细胞表位分析

利用BepiPred分析对该蛋白质上的B细胞线性表位进行了分析，发现它可能有9个潜在的抗原表位（aa15-aa22，aa50-aa54，aa82-aa92，aa121-aa127，aa141-aa155，aa161-aa169，aa197-aa202，aa210-aa226，aa240-aa256）。相应表位的序列见表1。

表1　细粒棘球绦虫14-3-3zeta抗原肽分布Table 1The epitopes distribution of Eg14-3-3zeta

3.5蛋白质二级结构预测

预测结果显示，该蛋白质二级结构以α螺旋（H）为主，占74.6％；β折叠（E）占52％，无规则卷曲（T）占13.3％，见图3。

3.6蛋白质三维结构预测

应用Swiss-model在线分析系统和三维视屏程序对细粒棘球绦虫14-3-3zeta进行三维结构的同源建模，并将多聚体结合位点和多肽结合位点以聚集成团的方式显示出来，见图4。

3.7同源性和进化树分析

将已知的其他物种的14-3-3zeta，包括人（NP_663723.1）、大鼠（NP_037184.1）、恶性疟原虫（AAC17516.1）、华支睾吸虫（AE089649.1）、曼氏迭宫绦虫（AGC74030.1）、马来布鲁丝虫（CDP94500.1）、多房棘球绦虫（CDJ05598.1）、小口膜壳绦虫（CDS31680.1）与细粒棘球绦虫14-3-3zeta的推测氨基酸序列进行多序列比对，结果如图5所示，图中显示了细粒棘球绦虫14-3-3zeta与多房棘球绦虫、小口膜壳绦虫的亲缘关系最近，属于同一分支，同源性分别为99％和86％。同时，我们将Eg14-3-3zeta与人和大鼠的14-3-3zeta进行了全长序列的对比，显示了细粒棘球绦虫与人和大鼠在该基因上的同源程度分别为60％和56％，结果如图6所示。

图3　细粒棘球绦虫14-3-3zeta的二级结构Figure 3The secondary structure of Eg14-3-3zeta by predictprotein

图4　Swiss-model分析细粒棘球绦虫14-3-3zeta的三维结构Figure 43D structure model of Eg14-3-3zeta

图5　细粒棘球绦虫14-3-3zeta的分子进化树Figure 5Molecular evolution tree of the Eg14-3-3zeta

图6　细粒棘球绦虫14-3-3zeta与其他物种14-3-3zeta的序列比对Figure 6Alignment of Eg14-3-3zeta amino acid sequence with 14-3-3zeta from other species

4　讨论

14-3-3蛋白广泛存在于植物、酵母、蠕虫、原虫、昆虫以及人类等多种哺乳动物真核细胞内，是高度保守的多功能蛋白质，它能够与靶蛋白磷酸化的丝氨酸或苏氨酸的位点结合，参与细胞内信号传递，在细胞发育、分化、增殖、凋亡、免疫应答反应以及肿瘤的转化等过程中都起到非常重要作用［8-9］。14-3-3蛋白在细胞信号传导代谢过程中与一些病理反应密切相关，因此以信号通路作为靶点进行疾病治疗是目前生物学界研究的热点。而在寄生虫中，14-3-3蛋白功能主要体现为调节虫体的增殖和发育，在不同的生长阶段，例如幼虫、成虫、虫卵，都存在着不同的14-3-3蛋白异构体调节与发育相关蛋白的活性［10］，因此将其作为疫苗候选分子也获得了肯定［11］。有文献报道，弓形虫14-3-3蛋白能够诱导BALB/c小鼠产生有效的免疫应答，说明其具有一定的抗原性和免疫原性，是一种新型的疫苗候选分子［12］，而这为14-3-3蛋白作为其它寄生虫疫苗和药物靶蛋白的研究提供了坚实的基础。有研究表明，14-3-3蛋白广泛存在于血吸虫的成虫及虫卵中，是血吸虫成虫及虫卵排泄分泌物中的高丰度蛋白质分子，因此信号传导蛋白14-3-3可作为血吸虫高丰度循环抗原之一，具有一定的诊断价值［13］。

本研究运用了生物信息学技术对细粒棘球绦虫14-3-3zeta的理化性质、结构、功能进行预测和分析，该基因全长为771 bp，编码256个氨基酸，其编码的蛋白相对分子量理论预测值和等电点分别是29.4 kDa和5.04，属于非稳定性蛋白，蛋白质的总体呈疏水性，定位于细胞内，这有助于采取合理的克隆和表达方法，提高目的蛋白的表达效率，获得活性重组蛋白。预测该蛋白无信号肽和跨膜区，二级结构含8个α-螺旋和12个β-折叠股，氨基酸序列中有9个潜在抗原表位。三维结构和功能域预测结果显示，细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白有多个多肽结合位点和多聚体结合位点，说明该蛋白能够与多种配体结合成为信号转导和细胞周期调控介质，通过相互之间的作用，参与多种生物学功能，这也提示了14-3-3zeta在虫体生长发育、生理代谢等过程中有重要作用。分子进化分析可见细粒棘球绦虫14-3-3zeta与多房棘球绦虫、小口膜壳绦虫的亲缘关系最近，属于同一分支，同源性分别为99％和86％。但是14-3-3zeta与人和大鼠在该基因上的同源程度分别为60％和56％，并且进化分析亲缘性较远，这提示了14-3-3zeta具有潜在的诊断价值。综上所述，我们初步认识了细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白的基本特征，这有利于我们今后合理的设计实验方案，深入了解细粒棘球绦虫14-3-3zeta的生物学功能，及其在虫体生长发育和致病过程中的作用，判定该蛋白是否有望能成为细粒棘球蚴病的防治和诊断的一个重要靶标。

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Application of bioinformatic analysis in 14-3-3zeta protein of Echinococcus granulosus

FU Ruijia，LV Gang，YIN Feifei，LIANG Pei★
（School of Tropical and Laboratory Medicine，Hainan Medical University，Haikou，Hainan，China，571101）

ObjectiveTo predict and analyze the structure and function of 14-3-3zeta protein from Echinococcus granulosus by bioinformatics technology.MethodsThe structure and function of Eg14-3-3zeta protein was identified from two biological information sites，USA National Center for Biotechnology Information（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），and Expert System for analysis of protein of the Swiss Institute of bioinformatics（ExPASY，http：//expasy.org/），which offer the analysis of various related gene and protein sequence，structure information tools，and other bioinformatics analysis software.ResultsThe fulllength cDNA sequence encoding Eg14-3-3zeta included a complete open reading frame（ORF）of 771 bp coding to a putative protein with 256 amino acids.Molecular weight of Eg14-3-3zeta was predicted to be 29.4 kDa and its isoelectric point was 5.04.The protein had no signal peptide site and transmembrane domain.Secondary structure of Eg14-3-3zeta contained 8 alpha-helices and 12 beta-strands.There were 9 potential epitopes in the sequence of amino acids of Eg14-3-3zeta.ConclusionThe characteristics of 14-3-3zeta protein from Echinococcus granulosus was identified.

Echinococcus granulosus；14-3-3zeta；Bioinformatics；Structure；Function

·论著·

国家自然科学基金（81260254）；海南省自然科学基金（814289）

海南医学院热带医学与检验医学院，海南，海口571101

梁培，E-mail：liangpeilp@163.com