蛋白质组学在肝细胞癌诊断研究中的进展与展望

彭征 戴盛明★

·述评·

蛋白质组学在肝细胞癌诊断研究中的进展与展望

彭征 戴盛明★

近些年研究发现，对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）进行蛋白质组学研究有助于寻找新的能更早期、更准确、更直接地反映HCC病情的蛋白肿瘤标志物或蛋白质组模式。笔者从血清、组织和细胞阐述该领域的最新研究进展与发展前景。

肝细胞癌；蛋白质组学；肿瘤标志物；蛋白质组模式

HCC（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率都位居全球第一，严重威胁着我国人民的健康水平［1］。HCC侵袭性极强，预后差，早期诊断、早期治疗对HCC尤其重要。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是目前临床诊断HCC最常用的肿瘤标志物之一，但存在敏感性不高（70％左右）、特异性较低（64％）等缺点。寻找新的HCC早期诊断指标物是HCC相关研究的一大热点。蛋白质组学（proteomics）是一门大规模、高通量、系统化研究某一类型细胞、组织、体液中的所有蛋白质组成、功能及蛋白之间相互作用的新兴学科。随着蛋白质组学的兴起，国内外众多研究学者纷纷把目光投向这个新兴领域，力图通过对HCC蛋白组的分析，从整体、动态、定量的角度去研究HCC发生发展过程中蛋白质种类、数量、性质、功能及其动态改变，寻找到新的能更准确、更直接反映HCC病情的蛋白诊断指标或蛋白质组模式，并用于HCC的早期诊断［2］。蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。目前国内外对HCC蛋白组学的研究主要集中在表达蛋白组学方面，并分别从血清水平、组织水平和细胞水平3个层面展开。本文从这3个方面就近年来国内外学者在HCC蛋白质组学的研究进展进行阐述。

1　蛋白质组学概述

蛋白质组（proteome）一词由澳大利亚Macquarie大学的Marc Wilkins和Keith Williams 2位科学家在1994年意大利Siena召开的双向电泳会议上首次提出，代表基因组表达的全套蛋白质。现在一般指某一物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液在精确控制其环境条件之下，特定时刻的全部蛋白质表达图谱。1995年Wasinger发表第一篇关于蛋白质组的论文，并提出蛋白质组学（proteomics）一词。1996年澳大利亚成立第一个蛋白质组研究中心。1997年法国召开第一届国际蛋白质组学会议。从此蛋白质组学在各国政府机构的重视和支持下进入飞速发展阶段，并成为生命科学的一个全新领域。蛋白质组学研究流程大致分为分离和鉴定分析2步。首先从体液、组织或细胞中提取蛋白质，然后去除无关的蛋白，并对获取的感兴趣的蛋白部分进行生物质谱分析，最后对得到的蛋白数据进行比对和鉴定。其主要技术手段有双向凝胶电泳、差异凝胶电泳、质谱分析、蛋白质芯片技术等，其中质谱技术包括生物质谱、飞行时间质谱、电喷雾质谱等，通常与其它分离和标记技术联用，具有灵敏、准确、自动化程度高等优点，是蛋白鉴定的核心技术［3］。

2　HCC蛋白质组学研究进展

2.1血清水平的HCC蛋白质组学研究

血清水平的HCC相关蛋白研究已经发现了一些新的诸如AFP-L3、GP73等与HCC诊断、进展和预后相关的标志物。一项在泰国和冈比亚开展的临床研究中［4］，研究人员将收集的10例HCC患者、10例慢性肝病患者（CLD，含HBV和HCV）、10例健康对照的血清进行蛋白组学分析，通过差异比对，最终选取了差异最显著的骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和人潜伏转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）作为候选蛋白进行后续的大批量独立交叉验证。通过对183例HCC患者、274例CLD患者和227健康人血清进行ELISA分析，他们发现在区分CLD患者和AFP＜20 ng/mL的HCC患者的方面，OPN联合LTBP2检测的受试者工作曲线下面积（AUC）能达到0.85。另外，他们对来自韩国的115例CLD患者进行了为期6年的前瞻性队列研究，发现共有21例患者发展为HCC，而且这21例患者的血清OPN和LTBP2水平在被确诊为HCC两年前已显著升高。在另外一项研究中［5］，研究人员收集了183名HCC和肝硬化志愿者的血清，从血清蛋白中分离出N-连接糖蛋白并甲基化后，通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术筛选可区分HCC和肝硬化的肿瘤标记物。通过对所获取的数据进行全球比对和量化分析，他们找到了11种在HCC和肝硬化之间差异表达的N-连接糖蛋白，并发现这些N-连接糖蛋白与糖基转移酶的活性密切相关，而后者可调节肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。在另一项研究中，研究人员对399例尼日利亚HCC患者的3个共血清的混合样本进行液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱法分析后，发现了26个差异表达蛋白，并通过酶联免疫吸附测定法对其中的血红素结合蛋白（Hp）、α-1-抗胰蛋白酶（α1-AT）、载脂蛋白A1（APOA1）和补体C3等4个蛋白进行验证。结果表明这些蛋白在区分肝硬化和HCC方面的检测效力远大于谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT），而且其灵敏度、特异度和AUC等指标均高于AFP［6］。在一项15例无血管侵袭、15例微血管侵袭和15例大血管侵袭HCC患者的血清标本蛋白组学比较研究中，研究人员发现24种差异蛋白。接着他们对这些蛋白进行了两个队列的验证标本组Western blot验证，并采用ELISA方法进行了387例标本的大批量验证和200例组织标本的免疫组化定位分析，免疫组化结果显示对氧磷脂酶-1（paraoxonase 1，PON1）与血管侵袭程度相关；ELISA结果显示PON1对HCC血管转移诊断效力很高，微血管侵袭和大血管侵袭的AUC分别为0.847和0.889，并认为PON1与HCC血管侵袭的发生关系密切［7］。而Ying等［8］收集了32例HCC患者、16例慢性肝炎患者、16例肝硬化患者和16例健康人的血清，通过运用弱阳离子交换型（WCX）纳米磁珠联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行检测，并使用ClinPro Tools v2.2软件对结果进行分析，建立可以将3组区分的肽组合模式。最终质荷比为5 247.62、7 637.05、1 450.87、4 054.21、1 073.37、3 883.6、5 064.37、4 644.96、5 805.51、1 866.47、6 579.6等的11个肽峰被筛选出并组成了一个可以明确将HCC患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者以及健康人区分开来的肽组合模式［7］。在另外一项包含57例HCC患者、27例肝硬化患者、37例慢性肝炎患者和52例健康人的血清的比较蛋白组学研究中，研究人员通过基于抗体的检测，比较人羧酸酯酶1（hCE1）和AFP的诊断灵敏度与特异度。经过约登指数和AUC分析，发现hCE1在HCC中的水平明显高于其它组，AUC为0.918，而AFP为0.744，二者联合检测为0.938。通过这些结果，他们认为hCE1在鉴别HCC和肝硬化方面具有更好的灵敏度和特异度，在HCC诊断方面和AFP显示出很强的互补性［9］。另外一组研究中，研究成员根据2002国际抗癌联盟制定的TNM分期标准收集了28例发生转移的HCC患者血清和28例未转移HCC患者血清，运用小麦胚芽凝集素对这些标本组成的混合样本进行凝集素亲和层析来纯化和富集血清中的糖蛋白，并进一步进行8标iTRAQ技术结合2D LCMS/MS分析，共发现了15个差异糖蛋白，其中9个上调，6个下调。而且他们通过Western blot和生化方法对α-1-抗胰蛋白酶（SERPINA1）和APOA1进行了验证，并认为SERPINA1有望成为HCC转移的糖蛋白分子标志物［10］。而在另外一项涉及80例HCC患者、80例肝炎患者和60例健康人血清的研究中，研究者通过SELDI-TOF-MS技术寻找新的HCC标志物，最终发现质荷比为7 777.27的蛋白质仅在HCC血清表达，经肽质量指纹谱鉴定为巨噬细胞炎性蛋白15（CCL15），并进行了免疫组化验证。另外，他们还通过细胞迁移和侵袭实验，认为CCL15可能在肿瘤侵袭迁移中发挥作用，并有望成为新的HCC诊断标志物［11］。

2.2组织水平的HCC蛋白质组学研究

肝癌组织标本的蛋白组学分析结果，可以最直接的获取反映HCC进展的蛋白标志物或蛋白组模式。正是基于这样的研究思路，一组研究人员对复发和非复发HCC患者的既往组织标本进行双向电泳和MALDI串联飞行时间质谱技术分析，结果他们发现了148个差异表达的蛋白点，其中差异在2倍以上的有12个，并通过免疫组化分析和Western blot检测，最终筛选出70 kDa热休克蛋白1（HSP70）、精氨基琥珀酸合成酶（ASS1）和UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶亚型2（UGP2）等3个蛋白可作为HCC复发的预测指标，而且这3个指标联合检测可以取得很高的灵敏度和特异度［12］。另一组研究人员收集了71例HCC患者的癌组织和癌旁组织标本，通过免疫组化分析，他们发现骨膜素（periostin，POSTN）在HCC组织阳性表达率可达73.2％，而癌旁组织仅有19.7％，并通过相关性分析发现POSTN与HCC结节、血管侵袭、肿瘤分级等临床病理特征相关。另外，他们还发现POSTN阳性表达的HCC组织有更高的血管密度和血管内皮生长因子浓度［13］。另外，Sun等［14］通过运用多蛋白酶消化和固相标记法获取HCC组织和正常肝组织的N连接糖蛋白组，并通过GoMiner软件进行量化检测。结果发现多蛋白酶消化可提升N连接糖蛋白组的覆盖范围和定量准确度，而且通过比较膜和分泌蛋白中N型糖蛋白的表达百分比，发现HCC组织N型糖蛋白百分比明显高于正常肝组织，并认为蛋白质的糖基化可能在HCC的发展中发挥重要的作用。而另一组研究人员对收集的组织标本进行多凝集素亲和层析，纯化和富集血清中的糖蛋白后，通过2DE和MS联合分析，发现28个差异表达蛋白。经Western blot分析，证实结合珠蛋白和肝羧酸酯酶1在HCC水平相对下降，而与刀豆蛋白凝集素A特异结合的组织蛋白酶D前体（ConA-pCD）明显升高，AUC分析显示ConA-pCD对肝癌诊断的敏感度和特异度可分别达到85％和80％，认为ConA-pCD有望成为HCC诊断标志物［15］。在另外一项包含HCC组织标本和非肿瘤肝组织标本各7例的研究中，研究人员通过运用双向胶内差异凝胶电泳和LC-MS联用等蛋白质组学定量技术，发现了573种差异表达蛋白。并经过进一步研究发现，只有51种差异表达蛋白和研究方法等因素无关，并通过Western blot和免疫组化分析证实了无机焦磷酸酶1、肿瘤坏死因子受体相关蛋白l、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1（BHMT）、穹隆主体蛋白（MVP）、凝溶胶蛋白和氯化物细胞内通道蛋白1等6种蛋白在肝癌组织呈高表达。但在后续的33例验证标本组的实验中，只有MVP和BHMT通过验证，认为二者是潜在的HCC肿瘤标记物［16］。另一组研究人员利用基质辅助激光解吸附电离成像质谱技术，对收集的30例微血管侵袭和26例无微血管侵袭HCC组织进行比较分析后，发现了30个差异表达的蛋白峰，有28个在伴有微血管侵袭的HCC组织高表达，其中2个蛋白峰经进一步鉴定分别为N-乙酰H4-K20（甲基化）和N-乙酰H4-K20（甲基化）-K16（乙酰化），而且这2个蛋白在独立的验证标本组通过验证，可望成为HCC微血管转移的早期标志物［17］。Guo等［18］根据巴塞罗那临床HCC分期标准收集了15例早期HCC和25例晚期HCC组织标本，通过双向凝胶电泳和质谱联用等蛋白质组学定量技术寻找差异表达蛋白，结果发现蛋白点SSP2215在早期HCC组织表达显著增高，经过MALDI-TOF/TOF质谱鉴定和数据比对发现是异质性胞核核糖核蛋白K（hnRNP K），并进一步通过Western blot和免疫组化分析得到证实。另外，他们发现hnRNP K对早期HCC诊断灵敏度可达66.67％，特异度可达84％，明显高于血清AFP。而hnRNP K和血清AFP联合检测对早期HCC诊断灵敏度和特异度可分别提高到93.33％和96％。在另一项研究中，研究人员对比了27例HCC患者的癌组织标本和相应的癌旁组织标本的2DE图谱，找到了43个差异蛋白质点，经液相色谱-质谱（LC-MS）联合检测获得串联质谱图，22个差异在2倍以上的蛋白经SEQUEST被鉴定出来，包括15种上调和7种下调表达的蛋白；并通过RT-PCR、Western blot和免疫组化分析证实过氧化物酶3（PRDX3）在HCC组织高表达，而且与HCC低分化等临床病理特征相关［19］。另外，在一项涉及40例HCC患者癌组织和相应癌旁组织标本、20例肝硬化患者组织标本以及无肝脏疾病的供体捐赠的肝组织标本的研究中，研究人员通过运用双向电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等蛋白质组学手段，发现人核纤层蛋白B1（LMNB1）和人波形蛋白（vimentin，VIM）在HCC组织水平明显高于癌旁组织、正常肝组织和肝硬化组织，并通过对收集的血清标本进行ELISA检测和PCR分析，ELISA检测显示VIM对早期HCC诊断灵敏度为40.91％，特异度为87.5％，PCR分析显示LMNB1的mRNA水平对早期HCC诊断灵敏度为76％，特异度为82％。通过与AFP比较，他们认为LMNB1和VIM有望成为新的HCC分子标志物［20］。

2.3细胞水平的HCC蛋白质组学研究

由于技术方法的限制，血清和组织水平的蛋白组学研究不能反映在细胞水平的低丰度蛋白变化，但这些蛋白却往往是很重要的调控因子，获取这些蛋白的变化对于HCC的进展、预后等判断帮助会更大。在一项针对Hep3B细胞的研究中［21］，研究人员中对肿瘤干细胞克隆株和对照株在球体形成、耐药性和致瘤性方面进行比对分析，并通过同位素相对标记与绝对定量iTRAQ技术对二者的蛋白表达谱进行分析，从鉴定出的1 127个蛋白中筛选出50个在这株克隆间差异两倍以上的蛋白，通过GeneGo软件进一步分析发现这些蛋白分别参与代谢通路、免疫应答以及细胞骨架重构，并和HCC等肝脏疾病相关。另外，在这50个蛋白中，他们发现S100P、S100A14和VIM等存在于多个HCC细胞系，并对S100A14和VIM的功能做了进一步研究和确认。而另一组研究人员则通过“细胞表面捕获（CSC）”方法对HepG2细胞系进行了细胞表面糖蛋白分析，系统收集HCC细胞表面蛋白信息，从而对HCC进行有效鉴定和分期，并找到更多的可用于检测和诊断的生物分子标记。最终他们在79种蛋白的116个单肽糖上发现了119个糖基化位点，82％属于膜蛋白，68％具有跨膜域，其中65个是首次发现。另外，他们在肿瘤细胞膜发现了26个CD抗原分子，并发现CD44、CD147、EGFR等和肿瘤密切相关［22］。来自美国的一组研究人员则首先运用蛋白组学技术研究发现Annexin A2在HCC中明显表达上调，然后他们运用免疫组化和ELISA分别在224例组织标本、95例早期HCC和74例AFP阴性HCC血清标本进行验证，免疫组化结果显示Annexin A2在60.7％的HCC组织过表达，ELISA结果显示Annexin A2在HCC患者血清水平明显增高，并在83.2％早期HCC和78.4％AFP阴性HCC呈过表达，诊断早期HCC的AUC曲线下面积为0.79，而AFP的AUC曲线下面积为0.73。而且Annexin A2和AFP联合检测可大大提升检测效力，灵敏度可达87.4％。另外，这些检测结果也在HCC模型小鼠中得到验证［23］。而Pan等［24］先期通过对收集的组织标本进行免疫组化分析，发现VIM在HCC呈高表达，并与肿瘤分级和侵袭性相关，接着在HCC细胞系SK-Hep-1进行针对波形蛋白的基因沉默实验，发现SK-Hep-1细胞侵袭性和转移性明显下降，认为波形蛋白在调节HCC转移方面具有重要作用。另外，他们还结合其他相关的波形蛋白蛋白组学研究结果，认为波形蛋白通过提升泛素系统的活性从而起到抑制细胞骨架蛋白表达和促进其降解的作用。在另外一项研究中，研究者通过对比5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药的HCC细胞系Bel7402/5-FU和其父本细胞系BEL7402的二维凝胶电泳图谱，并使用iTRAQ结合LC-MS/MS技术获得串联质谱图，最终从660种蛋白中筛选出52种在这两个细胞株明显差异表达的蛋白，并对其中一些蛋白进行Western blot和荧光定量PCR验证。其中在Bel7402/5-FU细胞株高表达的膜联蛋白A3（ANXA3）被证实和多药耐药性密切相关［25］。

3　讨论

HCC蛋白组学可以让我们从整体角度，动态地量化地观察HCC发展过程中蛋白质种类数量和修饰状态等方面的改变，丰富了我们对HCC的认知。随着技术的进步和研究的深入，新的HCC相关蛋白质或蛋白质组模式不断涌现，Masuzaki等总结了2012年以前HCC相关研究，列举了AFP-L3、DCP、GPC3、OPN、IGF-1、VEGF、VEGFR-1等备选蛋白标记物［26］。Liu等遴选了16篇HCC蛋白标记物相关研究报道，并对研究结果进行了整理，发现了27种报道三次以上且研究结论相互一致的蛋白，其中HSP70表达上调［27］。本文对近三年来HCC蛋白组学的最新研究成果进行综述，并按照它们在HCC的早期诊断、鉴别诊断、复发和转移预测等多个方面的功能进行了归类（见表1）。通过表1我们可以发现，在对新发现的HCC相关蛋白的大批量标本验证方面还有大量的工作要做。随着新肿瘤标记的研究不断加强，如何将这些新指标与传统诊断指标结合并制定标准化检测方法，并最终实现服务临床也是今后发展的方向。另外，作为一个子学科，HCC蛋白组学也存在不少蛋白组学发展中遇到的共性问题，如低丰度蛋白、极酸极碱蛋白和溶解性差的蛋白的分离和鉴定，而且目前尚无统一的操作标准和程序，加上受到样本质量、制备方法、仪器性能等诸多因素影响，导致不同学者的研究结果不尽相同。因此，规范标本采集和制备程序、提升蛋白质分离和鉴定技术是目前蛋白组学研究首要解决的问题。相信随着技术的进步和研究的深入，越来越多的HCC相关蛋白质或蛋白质组模式将被发现，并对HCC的早期预防、诊断和治疗提供帮助。

表1　本文综述涉及的HCC相关蛋白分类归纳表Table 1Classification table of hepatocellular carcinoma associated proteins involved in this review

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New progress and future direction of diagnostic research in hepatocellular carcinoma proteomics

PENG Zheng，DAI Shengming★
（Liuzhou Key Laboratory of Tumor Diseases and Prevention，Clinical Laboratory，Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545005）

Proteomics research on HCC helps to find new more accurate，more direct protein biomarkers or proteomic patterns for the early diagnosis of HCC.This paper expatiates on new advances and prospects in this field from serum，cell and tissue aspect.

Hepatocellular carcinoma；Proteomics；Tumor marker；Proteomic pattern

广西柳州市科技局科技创新能力与条件建设资助项目（2014G020403）

广西医科大学第四附属医院医学检验科，柳州市肿瘤疾病与防治重点实验室，广西，柳州545005★

戴盛明，E-mail：daishm@sina.com