Survivin蛋白、CDX2在结直肠癌及癌前病变中的表达和意义

姚凡保　付　汐　邝倩仪　马海生

Survivin蛋白、CDX2在结直肠癌及癌前病变中的表达和意义

姚凡保付汐邝倩仪马海生

目的探讨Survivin蛋白、CDX2在结直肠癌及癌前病变中的表达，为结直肠癌的早期诊断、基因靶点治疗、评估预后、判断复发提供新的标记物。方法收集结直肠癌、腺瘤伴高级别上皮内瘤变、腺瘤伴低级别上皮内瘤变及正常对照组各30例，应用免疫组化方法分别检测各组中Survivin蛋白、CDX2的表达情况。结果Survivin蛋白表达在腺癌组、高级别上皮内瘤变组、低级别上皮内瘤变组及正常组各组间均有明显差异（P＜0.01）；CDX2表达在腺癌组与低级别瘤变组、正常组之间，高级别上皮内瘤变组与低级别上皮内瘤变组、正常组之间，低级别上皮内瘤变组与正常组之间均有显著差异（P＜0.01），而腺癌组与高级别组之间无明显差异（P＞0.05）。Survivin与CDX2的表达呈高度密切负相关（r＝-0.64，P＜0.01）。结论Survivin蛋白、CDX2是结直肠癌发生发展的重要生物学标记物，两者有密切相关性，联合检测可为结直肠癌早期诊断、基因靶点治疗、评估预后、判断复发提供新的手段。

Survivin；CDX2；结直肠癌；上皮内瘤变

结直肠癌（colorectal carcinomor，CRC）是我国常见的恶性肿瘤之一，且发病率有逐年递增趋势，其晚期疗效不佳，发生腹腔或肝脏等处转移则预后极差，但如及时发现结直肠早癌，予内镜下切除或外科治疗，结果则绝然不同。结直肠癌的早诊早治目前尚有一定难度［1］，因此，寻找一简便快捷早期诊断结直肠肿瘤的手段一直是医学研究的热点。有研究表明［2］，结直肠癌的组织学发生是一个缓慢演进的过程，肠道生态改变、基因变异等多因素参与其中，可能大部分经历低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-腺癌的过程。期间，多种生物分子参与其中，并促进了细胞生物学行为的改变。Survivin蛋白是目前发现作用最强的凋亡抑制因子之一，具有调节细胞周期等多种生物活性作用，与抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤发展相关［3］。尾侧型同源转录因子2［4］（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）是一种特异性的核转录因子，能调节肠道特异基因的转录，目前它被认为是一种肿瘤抑制基因。本研究应用免疫组化方法检测Survivin蛋白、CDX2在结直肠癌和癌前病变中的表达，探讨Survivin蛋白、CDX2在结直肠癌发生发展中的作用及预后。

材料与方法

一、临床资料

收集2011年12月至2013年12月佛山市三水区人民医院经病理证实为结直肠癌标本、腺瘤伴高级别上皮内瘤变标本、腺瘤伴低级别上皮内瘤变标本各30例，正常结直肠黏膜活检标本30例作为对照组。男68例，女52例年龄19～89岁。所有标本以10%中性甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋切片，切片厚4 μm。

二、主要试剂

CDX2和Survivin一抗工作液、HRP二抗及DAB显色试剂购自广州深达生物制品技术有限公司。

三、方法

采用Envision免疫组织化学二步法。石蜡切片常规脱蜡至水，CDX2使用0.01 M柠檬酸缓冲液高温高压修复3 min，Survivin使用EDTA缓冲液（pH 8.0）高温高压修复6 min。蒸馏水洗，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS洗涤3 min×3次，滴加ALDH1（稀释浓度1：100）及Survivin一抗，以0.01 mol/L PBS液（pH 7.4）替代一抗作为阴性对照，37℃孵育60 min，PBS洗涤3 min×3次，滴加HRP二抗，37℃孵育30 min，PBS洗涤3 min×3次，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。

结果判断：根据染色强度及显色细胞比例对结果进行评分。按切片中显色细胞百分比及显色深浅进行评分：无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按显色细胞比例进行评分：＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。以上述两项评分之和作为每一例的评分。

表1　CDX2和Survivin表达与临床病理参数之间的关系

四、统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件包对数据进行处理，使用t检验、Fisher精确检验、方差分析及Pearson相关分析，检验水准α＝0.05。

结果

Survivin阳性染色定位于胞浆。CDX2阳性染色定位于细胞核。CDX2评分在腺癌组与低级别上皮内瘤变组、正常组之间，高级别上皮内瘤变组与低级别瘤变组、正常组之间，低级别上皮内瘤变组与正常组之间均有显著差异（P＜0.01），腺癌组与高级别上皮内瘤变组之间无明显差异（P＞0.05）。Survivin评分在各组间均有高度显著性差异（P＜0.01）。Survivin、CDX2表达与患者年龄、性别均无明显关系（P＞0.05）。两者评分值经等级资料相关分析呈高度密切负相关（r＝-0.64，P＜0.01），见表1、图1。

图1　结直肠癌免疫组化病理所见（均为免疫组化二步法，×200）。

讨论

尾侧型同源转录因子2（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）是一种特异性的尾型同源核基因，由311个单氨基酸构成，最先被Mlodzik从果蝇蛋白中分离而得。CDX2蛋白的DNA表达以螺旋环缭绕并和DNA的相应区域相结合的方式调节。CDX2分布广泛，在消化道如食管、胃、十二指肠、结肠、胰腺等上皮细胞中均有发现，其中十二指肠和结肠上皮细胞表达最强。CDX2的正常表达在肠道上皮细胞的发育和分化中发挥着极重要的调节作用，如果CDX2的表达降低或者缺失会导致一系列的基因调控异常，使促癌基因表达强于抑癌基因而导致肿瘤的发生。有研究显示，在结直肠癌细胞中，CDX2的表达显著降低，而其高表达有利于抑制肿瘤细胞无序的浸润生长、增殖。CDX2调控蛋白的表达从而产生抑癌作用的机制复杂，体内众多基因参与其中。Bain等［5］在HT-29结肠癌细胞系中发现CDX2的高表达能促进P21表达mRNA增强，从而抑制肿瘤细胞的DNA合成，从源头上阻断了肿瘤细胞的生长增殖。Guo等［6］还发现CDX2的表达能以剂量－依赖型的方式抑制β-catenin/TCF－4介导的Wnt信号传导途径。激活此途径可使肿瘤细胞转录表达增强，促进细胞的无序生长、增殖。CDX2高表达可有效抑制这一激活途径，从而抑制肿瘤细胞的分化、增殖。本研究中，CDX2在腺癌组织中表达明显低于低级别上皮内瘤变组织和正常组织，在高级别上皮内瘤变组织中表达明显低于正常组织，差异具有统计学意义。其表达程度一定程度反映了正常组织-癌前病变-癌变的过程，提示CDX2可能在结直肠癌的发生发展中发挥着重要作用，可能是结直肠癌重要的分子标记物之一。

Survivin是近年发现的凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）的一员，是IAP家族中最小一员，被认为是作用最强的凋亡抑制因子之一，其编码142个氨基酸，分子量为16.5 ku，包含两个特殊的结构：N-端含有一个杆状病毒IAP重复序列（BIR），该BIR区域可以通过抑制Caspase-3和Caspase-7的前体或直接抑制Caspase-3和Caspase-7本身的活性来发挥抗凋亡作用；C-端是由42个氨基酸的高电荷区所形成的疏水α螺旋卷曲结构，调节survivin与纺锤体上的中心粒微管蛋白结合。survivin蛋白广泛表达于胚胎组织及多数恶性肿瘤组织，成熟的正常终末分化组织不表达。Survivin具有抑制细胞凋亡及促进细胞增殖的作用，其通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性抑制肿瘤细胞凋亡，调节并对抗G2/M期细胞凋亡的诱导，使肿瘤细胞逃离凋亡触发点。同时它具有促进肿瘤血管生成作用，使它在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。有研究［7-8］表明，survivin在正常结直肠黏膜中无表达或低度表达，在结直肠腺癌中高表达，而癌组织的表达显著高于癌旁组织，推测survivin可能为结直肠癌发生早期的一种分子生物学改变，可作为结直肠癌早期诊断的指标，且survivin的表达与肿瘤的预后有关。本研究发现，survivin的表达在正常肠黏膜、腺瘤伴低级别上皮内瘤、腺瘤伴高级别上皮内瘤变及结直肠腺癌中递次增高，各组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。进一步揭示了survivin在结直肠腺癌组织学变化中的生物作用。

综上所述，CDX2与Survivin与结直肠肿瘤发生发展密切相关。Survivin抑制肿瘤细胞凋亡致肿瘤组织生长无序无度，而CDX2的缺失亦使肿瘤细胞的无序生长失控，本研究结果显示两者呈负相关性，提示两者在结直肠癌的发生机制中可能有内在关联，具体的相互影响机制还有待进一步研究。因此联合检测CDX2与Survivin有更助于判断结直肠癌及其癌前病变的生物学行为，可作为结直肠癌早期诊断、预后或治疗效果的监测指标，亦有望在分子靶向治疗方面提供新的途径。

1Van Gossum A.Guidelines for eolorectal cancer screening-a puzzle of tests and strategies.ActaClin Belg，2010，65（6）：433-436.

2贾光辉，薛军，武雪亮，等.RUNX3、Survivin在结直肠腺癌、腺瘤、正常黏膜中表达的临床意义.安徽医科大学学报，2013，48（10）：1228-1231.

3孔令建，赵晶，曲波，等.Survivin、COX-2及VEGF在大肠癌中的表达及与肿瘤微血管密度的关系.世界华人消化杂志，2009，17（10）：2048-2053

4Beck F，Chawengsaksophak K，Luckett J，et al.A study of regional gut endoderm potency by analysis of Cdx2 null mutant chimaeric mice.Dev Biol，2003.255（2）：399-406.

5Bai YQ，Miyake S，1wai T，et a1.CDX2，a homeobox transcription factor，upregnlates transcripti of the p21/WAFl，CIPL gene.Oncogene，2003，22（39）：7942-7949.

6Guo Pj，Edward Huang E，Ezaki T.et al.CKX1 Inhibits Hunam cloln cancer cell Proliferation by Reducing 3-catenin/TCF Transcrip tional Activity.J BiolChem，2004，279（35）：36865-36875.

7Altieri D C，Survivin，cancer networks and pathway-directed drug discovery.Nat Rev Cancer，2008，8（1）：61-70.

8Hsiao H L，Wang W S，Chen P M，et a1.Overexpression of thymosin beta-4 rendem SW480 colon careinoma cells more resistant to apoptosis triggered by FasL and two topoisomerase II inhibitors via downregulation Fas and upregulation Survivin expression，respectively.Careino genesis，2006，27（5）：936-944.

Expression and significance of Survivin protein，CDX2 in colorectal cancer and precancerous diseases

YAO Fan-bao，FU Xi，KUANG Qian-yi，MA Hai-sheng.
Foshan Sanshui District People′s Hospital of the digestive department 528100

Objective To investigate the expression of Survivin and CDX2 in colorectal cancer，and to discuss the role of biological markers in early detection of colorectal cancer，genetically targeted treatment，assessment of prognosis，diagnosis of recurrent.Methods Collecting the colorectal cancer，adenoma with highgrade intraepithelial neoplasia，adenoma with low grade intraepithelial neoplasia and normal control group with 30 cases in each group，then detecting the expression of Survivin and CDX2 with immunohistochemistry.Results The expression of Survivin protein in the cancer group，high grade intraepithelial neoplasia group，low grade intraepithelial neoplasi a group，normal group were significantly different（P＜0.01）；the expression of CDX2 in adenocarcinoma group showed significant difference with low grade neoplasia group and normal group，high grade intraepithelial neoplasia group showed significant difference with low grade intraepithelial neoplasia group and normal group，low grade intraepithelial neoplasia was significantly different with normal group（P＜0.01），while no significant difference between the adenocarcinoma group and high grade intraepithelial neoplasia group（P＞0.05）.The expression of Survivin was highly negative correlated with CDX2（r= -0.64，P＜0.01）.Conclusion Survivin protein and CDX2 are the important biological markers in the development and progression of colorectal carcinoma，there is a close relationship between them，joint detection of survivin and CDX2 could be a new method for colorectal cancer early diagnosis，gene targeting therapy，evaluation prognosisand recurrence.

Survivin；CDX2；colorectal cancer；intraepithelial neoplasia

2015-07-13）

（本文编辑：吴保平）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.003

528100佛山市三水区人民医院消化科