葡萄酒有机酸研究现状及应用展望

莫燕霞，殷居易，顾晓俊，陈梅珍，何卫敏，吴维儿

（宁波出入境检验检疫局，浙江宁波315800）

葡萄酒有机酸研究现状及应用展望

莫燕霞，殷居易，顾晓俊，陈梅珍，何卫敏，吴维儿

（宁波出入境检验检疫局，浙江宁波315800）

有机酸成分研究是探索葡萄酒中呈味物质与地域环境、酿酒工艺、葡萄酒质量等关系的重要手段。本文介绍了葡萄酒中主要有机酸种类及其在发酵过程中的变化，综述了葡萄酒中有机酸的分析检测方法，并对葡萄酒中有机酸成分研究的发展趋势及应用进行了展望。

葡萄酒，有机酸，分析方法，应用

葡萄酒都含有酸味物质，其对于葡萄酒的味感、稳定性的形成和陈酿特性具有重要作用。适量的酸味物质是构成葡萄酒爽利、清新等口感特征的要素。酸度过低，酒体会平淡乏味；酸度过高，酒体生硬粗涩［1］。有机酸的种类、浓度与葡萄酒的类型和品质优劣有很大关系，调节着酸碱的平衡，影响葡萄酒的口感、色泽及生物稳定性。葡萄酒中每种酸各有特点和功效，在葡萄酒中发挥着不同的作用。有机酸的定量测定在葡萄酒品质鉴定中占有重要地位，已经越来越受到人们的关注［2-4］。

本文将围绕葡萄酒中主要有机酸的类型及其在发酵过程中的变化，分析方法的比较与评价进行综述，并对葡萄酒有机酸成分研究的思路和应用进行展望。

1　葡萄酒中主要有机酸

葡萄酒中主要有机酸有酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸。各有机酸分子结构见图1。酒石酸、苹果酸和柠檬酸源于葡萄浆果，另外三种酸是由酒精发酵和细菌活动形成。

酒石酸（Tartaric acid）又名葡萄酸，是葡萄和葡萄酒中的主要有机酸，也是葡萄的特征酸。酒石酸是抗葡萄果实呼吸氧化作用和抗酒中细菌作用的酸类，对葡萄着色与抗病有重要作用。葡萄酒中酒石酸含量大约为5～10g/L，决定着葡萄酒的pH，它的浓度主要取决于葡萄的品种特性及采收时果实大小。葡萄中存在的酒石酸的异构体是L（+）型，由葡萄糖经过发酵产生［5］。随着时间的推移，葡萄酒中部分酒石酸会以酒石酸盐的形式存在。

图1　葡萄酒中主要有机酸的化学结构式Fig.1　Molecular structure ofmain organic acids ofwine

苹果酸（Malic acid）是葡萄果实中自然形成的有机酸之一，是葡萄酒酿造过程中的一种关键酸，对于确定葡萄是否成熟及葡萄酒酿造是否精心都有着重要的作用，尤其是红葡萄酒酿造过程中，适时地进行苹果酸-乳酸发酵对于提高酒的生物稳定性、改善酒质具有相当大的作用。葡萄中存在的苹果酸的异构体是L（+）型，由葡萄糖经丙酮酸合成［6］。苹果酸含量随葡萄品种以及成熟期温度条件引起的呼吸作用不同而有很大变化，其最终浓度也受浆果大小的影响。分析葡萄果实、葡萄汁、发酵液及葡萄酒中苹果酸含量可以帮助判断葡萄果实的成熟情况及成品葡萄酒质量的优劣情况。

柠檬酸（Citric acid）是葡萄的一种正常组分。不论生青葡萄或者成熟葡萄，都含有柠檬酸。纯粹的酒精发酵作用也经常产生少量的柠檬酸，其含量可达100～150mg/L。葡萄酒中柠檬酸的含量变化很大，相差1倍到10倍。红葡萄酒含有的柠檬酸往往少于白葡萄酒的含量，这是因为当细菌使红葡萄酒发生苹果酸乳酸发酵作用的同时，会平行地消耗现存的柠檬酸，消耗量几乎达到全部柠檬酸含量。

琥珀酸（Succinic acid）是葡萄酒所含有机酸类中最富有味觉反应的一种酸，味感复杂，既酸又苦，性状稳定，可溶于水和酒精，能抵抗细菌性发酵的破坏作用。

乙酸（Acetic acid）是挥发酸，是葡萄酒酿造储存过程的“晴雨表”，含量过高时不利于葡萄酒香气质量。Erasmus等［7］发现冰酒中含有高浓度乙酸，这可能是葡萄汁中高糖度产生的高渗透压影响酵母而使其生成的副产物。

乳酸（Lactic acid）是葡萄酒二次发酵阶段的苹果酸-乳酸发酵过程产生的，浓度范围大约为0～2.5g/L。乳酸的酸味比苹果酸低很多且稳定性高，所以乳酸发酵可使葡萄酒酸度降低且使酒体更加稳定，不易变质［8］。

2　葡萄酒发酵过程中主要有机酸的变化

在葡萄酒发酵过程中，一部分酒石酸会由于酒石酸氢钾的沉淀作用而失去，一部分酒石酸被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸，使挥发酸含量增加。苹果酸既可被酵母代谢，又可被合成。继酒精发酵后的苹果酸-乳酸发酵中，苹果酸可被转化成酒精或乳酸，而生成的乳酸，其爽滑口味可以提升葡萄酒的感官特征。乳酸能被醋酸菌氧化分解，乙酸发酵过程中乳酸含量会减少，凡是没有遭受细菌作用的葡萄酒，一般乳酸含量都较少。乙酸含量很少，当葡萄酒受到某些细菌污染后可产生大量乙酸。柠檬酸在酒精发酵过程中产生，随后在苹果酸-乳酸发酵中，会被当作底物平行地消耗，消耗量能达到全部含量，而消耗后使其主要变为挥发酸，不再有柠檬酸存在［9］，因此柠檬酸对葡萄酒风味影响较小，但有时会作为络合剂加入到葡萄酒中，吸附一些离子如Fe3+、Cu2+以防止金属凝胶的形成［10］。琥珀酸主要来自糖分子的发酵作用，少量来自于所含谷氨酸的变化，在谷氨酸存在时，琥珀酸积累增多［11］。

3　葡萄酒中有机酸的分析检测方法

葡萄酒中有机酸的主要检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、酸碱滴定法、纸色谱法、薄层色谱法等。笔者参阅国内外研究者的研究报告和文献，综述前人关于各种方法检测葡萄酒中有机酸的成果。

3.1高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是目前应用最多的色谱分析方法，HPLC系统由流动相储液瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成。与经典液相色谱相比有以下优点：速度快、分辨率高、灵敏度高、色谱柱可反复使用、样品量少且易回收等。它的分离模式与检测方法多种多样，可以根据样品的构成与性质来选择合适的色谱条件。

利用HPLC对葡萄酒中芳香族有机酸和多元酸进行直接测定，可以避免色素和杂质的影响，测定方法简便，快速准确。李小刚等［12］应用高效液相色谱法同时测定葡萄酒的有机酸及乙酸，各组分分离良好，结果满意。马丽艳等［13］采用日本资生堂CAPCELL PAK MG S5色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），乙腈-磷酸溶液为流动相等梯度洗脱，流速为0.5m L/m in，在210nm和243nm下检测，外标法定量，结果显示八种有机酸线性关系良好，平均回收率在85%～120%之间，精密度、稳定性的RSD均小于5%。Dopico［14］采用固相萃取法进行前处理，用高效液相色谱法和UV与光敏二极管检测器测定Vinho Verde葡萄酒中的有机酸和酚酸。陈文华等［15］利用高效液相色谱法（反相ODS色谱柱，磷酸溶液作流动相）测定通化野生原汁葡萄酒、王朝干白葡、野生山葡萄酒、张裕干红葡萄酒、野生原汁山葡萄酒中的酒石酸和柠檬酸含量。高年发等［16］对长城和王朝葡萄酿酒公司的15种原酒高速离心预处理后用HPLC测定其中有机酸含量。结果表明：葡萄酒中主要有机酸成分是酒石酸、L-苹果酸和L-乳酸，柠檬酸、琥珀酸和乙酸的含量很少；长城原酒中的总酸（以酒石酸为主）含量比王朝原酒中的高。谭志静［17］采用Hibarcolumn RT色谱柱，以磷酸盐缓冲溶液（pH=2.5）为流动相，在检测波长为214nm的条件下测定葡萄果肉和葡萄皮中有机酸（柠檬酸、苹果酸等）含量。李君霞等［18］同样采用高效液相色谱法分离葡萄酒中5种有机酸（酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸），色谱条件为：ODSC18反相柱（200mm× 4.6mm，5μm）；柱温30℃；以0.05mol/L磷酸二氢氨水溶液（pH 2.60～2.65）为流动相；进样量为20μL；流速1.0m L/m in；检测波长214nm；运行时间7m in。保留时间定性，ESTD法定量。5种有机酸在检测范围内呈良好线性关系，回收率在96%～102%之间，精密度实验的RSD小于10%。该方法操作简单，重复性好，准确度高，测定时间短。

高效液相色谱法灵敏度高，但是存在样品预处理操作繁琐、测定周期长、实验成本高、测定完后需要清除残留样品等缺点，若与其他技术联用，则能缩短检测周期、降低实验成本。

Vonach等［19］率先将高效液相色谱法（HPLC）与傅立叶转换红外光谱法（FTIR）联用，为葡萄酒中有机酸的检测提供了一种新的可行的直接测定方法。Edelmann等［20］将金刚石衰减全反射（ATR）元件装入具有低死体积的流通池，在线中红外检测与高效液相色谱法联用，分析红葡萄酒中有机酸、糖和醇类。用多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）进行定量分析。Akira Kotani等［21］将电化学还原醌的伏安法测定酸的方法应用于高效液相色谱法（HPLC），结合电化学检测（ED）检测酒中的有机酸（乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸）。使用离子排斥柱和电化学检测器与玻璃碳工作电极，含有2-甲基-1，4-萘醌水溶液的0.1mmol/L高氯酸和乙醇作为流动相和试剂溶液，分析物无需衍生，重复性好、过程简单快速。

3.2气相色谱法（GC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）

气相色谱使用成本较低，对环境友好，现已得到广泛应用，毛细管柱-气相色谱分析葡萄酒中的多元有机酸成分是葡萄酒成分鉴定、质量控制以及了解葡萄酒酸类特点的重要手段。葡萄酒有机酸种类繁多，有些组分含量极低，通过普通手段很难检测，而且有些组分在分离提取时容易受到条件的影响发生结构上的改变或者与其他外来物质结合。前处理新方法的开发和质谱联用技术的发展为葡萄酒多元有机酸成分分析工作提供了便利。对于含量较低和基质较复杂的葡萄酒样品，研究者新开发了以下几种柱前处理方法：固相微萃取、树脂富集界面衍生、酯化筛选衍生。

张岱等［22］采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术，对比分析了赤霞珠干化葡萄和干化葡萄酒的香气成分，检测出34种干化赤霞珠葡萄香气成分和45种干化葡萄酒香气成分，主要为醇类、有机酸、醛类等物质。杜曦等［23］应用衍生化气相色谱法分离测定葡萄、葡萄酒中多元有机酸，通过不同酯化方法比较，选择在N，N-二甲基甲酰胺非质子溶剂中，利用碘乙烷与多元有机酸的四甲基铵盐反应制备相应的乙酯，在SE-30色谱柱上利用程序升温进行分离，采用内标法鉴定分析及比较测定葡萄和葡萄酒中的多种多元有机酸性质和含量。王方等［24］以王朝赤霞珠、梅鹿辄两种干红葡萄酒为研究对象，利用液液萃取法提取香气成分，结合气相色谱-质谱联用技术检测葡萄酒中77种香气组分（包含乙酸、苹果酸、琥珀酸等有机酸）。李素岳等［25］采用固相微萃取（SPME）结合气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对玫瑰加香葡萄酒进行分析，鉴定出62种香气成分（含乙酸等有机酸类8种）。

3.3离子色谱法（IC）

离子色谱法操作简单，灵敏度高，可广泛用于多种样品的分析。按分离原理分为离子交换色谱（IEC）和离子排斥色谱（ICE）两种：IEC是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷离子及被测组分离子进行可逆交换，根据各离子交换基团具有不同电荷吸引力而分离，分离低分子有机酸时无须对样品进行复杂的预处理；ICE也是分析低分子质量有机酸的有效方法，具有以下优点：极适合于含水基体；对强亲水性物质不会造成损失；无需柱前衍生处理；几乎不受无机阴离子干扰。

Kupina［26］早在1991年就用离子色谱法（Dionex Onm iPac PAX-500柱）分离和定量分析了葡萄汁和葡萄酒样品中的主要有机酸（酒石酸、苹果酸和柠檬酸）。田鹏等［27］选用常见的盐酸溶液作淋洗液，以四丁基氢氧化铵为再生液，考察了淋洗液浓度、流量等因素对分离和测定的影响，对啤酒和白葡萄酒中常见有机酸在阴离子排斥色谱柱上的保留行为进行了系统研究。胡维胜等［28］选用色谱柱为Met rosep Organic Acids有机酸柱，Met rosep RP Guard保护柱，淋洗液选用0.3mmol/L硫酸和15%丙酮的混合溶液，再生液为10mmol/L LiCl，测定了麦汁和啤酒体系中柠檬酸等9种有机酸的含量。李振林［29］用DX-500型离子色谱仪，IonPac-AG4A2SC保护柱，IonPac-AS4A2SC分析柱，AD20型吸光度检测器与ED40型电化学检测器（电导检测方式）串联使用，分别在190、206nm检测波长处测定了葡萄酒中糖精钠、甜蜜素和柠檬酸的含量。原小寓等［30］采用Shim-pack SCR-102H型离子排斥色谱柱，选用2.0mmol/L p-甲苯磺酸-乙腈（体积比91∶9）为淋洗液，分离测定7种有机酸（柠檬酸、酒石酸、苹果酸等）。徐继明［31］以TSKgel Oapak2A色谱柱，以2mmol的苯甲酸为流动相，结合电导检测同时测定了葡萄酒中的多种有机酸（柠檬酸、苹果酸等）。林华影等［32］将样品经提取、脱色、过滤后用IonPac AS11分离柱分离，以EG 40自动淋洗液发生器生成的5～34mmol/LKOH为淋洗液洗脱，抑制电导检测器检测样品（含葡萄酒）中乳酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸等21种有机酸。张斯等［33］通过离子色谱法IonPac AS11（4mm×250mm）分析柱，0.2～25mmol/L KOH为淋洗液对赤霞珠、梅洛和西拉葡萄酒进行9种有机酸含量的测定（分别是乳酸、乙酸、丙烯酸、山梨酸、苯甲酸、苹果酸、酒石酸、富马酸和柠檬酸），共挑选100个来自法国、意大利、澳大利亚、智利和美国的葡萄酒样品进行测定。

离子色谱由于淋洗液和柱填料的特殊性，对样品中蛋白质含量有严格限定，不适合做复杂的样品分析，而且柱子的容量小，进样量少。因此，IC在测定葡萄酒中有机酸的过程中，需严格遵循以上检测要求。

3.4毛细管电泳法（CE）

毛细管电泳是以高压电场为驱动力、以毛细管为分离通道、依据样品中各组分之间淌度和分配差异而实现分离的一类液相分离技术，具有色谱和电泳两种分离机制［34］，具有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗少和污染小等特点［35］。基于毛细管便宜且更换简单等突出优点，毛细管电泳已经越来越广泛地被用于有机酸的分析测定［36］。

A.Castiñeira等［37］通过优化五种背景电解质，使用3mmol/L磷酸盐和0.5mmol/L十四烷基溴化铵（MTAB）于pH 6.5电渗流改性剂的电解液，直接进样后检测葡萄酒中酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乙酸和乳酸。该定量方法的加标回收率在90%～102%范围内，精密度小于1%。在2002年，A Castiñeira等［38］又使用磷酸盐基载体电解质和在pH 6.5下检测葡萄酒样中五种有机酸，该毛细管电泳方法在其他常用方法优点的基础上，使用有机酸的定量邻苯二甲酸缓冲液，UV检测，对酒石酸、苹果酸、乙酸、琥珀酸和乳酸的分离和测定大约在6m in内就可实现。R G Peres等［39］开发和验证了毛细管电泳法在葡萄酒中有机酸检测方面的有效应用，含0.2mmol/L十六烷基三甲基和pH为3.6、0.2mmol/L的3，5-二硝基苯甲酸溴（DNB）电解质作为反向流动液，254nm间接紫外吸光度检测。该方法表现出良好的性能特征：线性优异，检测和定量限低，分离时间短，变化注射系数均小于5%，回收率在95%～102%之间。李永库等［40］应用毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）联用法同时测定葡萄酒中草酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、酒石酸和乳酸8种主要有效成分含量。在未涂层石英毛细管（50μm×80cm）中，以40.0mmol/L醋酸铵（用1.0mol/L醋酸调至pH 4.5）为缓冲溶液，30%异丙醇（含3.0mmol/L氨水）为鞘液，分离电压25.0kV，各组分在15m in内得到完全分离。

毛细管电泳虽然已经得到广泛应用，但与其他分析方法相比，其灵敏度和重现性方面仍存在不足。随着各种高灵敏度检测器以及自动进样器的使用，不但可使测定精度和检测灵敏度大大提高，而且能完成连续自动进样及在线分析，使毛细管电泳技术能更加适合于实际应用。

3.5酶法（ED）

酶化学法是基于测定NADH酶或NADPH酶活性的增加或减少来检测有机酸，这些酶有自身的吸光区域，一般用分光光度计测其340nm处的吸光值。酶法主要优点在于特异性、专一性，使某些有机酸的L或D-异构体很容易被检测，缺点是每次实验中只有一个有机酸被测定，相对其他方法比较耗时。Jose等［41］运用流动注射系统，将NADH酶注入样品中，通过酶的变化同时检测葡萄酒中的L（+）乳酸和L（-）苹果酸。R Puchades等［42］使用酶固定化开管式反应器流动注射分析方法同时测定葡萄酒中的两种有机酸（苹果酸和乳酸），将苹果酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶注入流动注射系统（FIA），通过荧光法测定产物NADH酶的量来分析苹果酸和乳酸。

3.6其他方法

葡萄酒中有机酸的测定方法还有酸碱滴定法［43］、比色分析法［44］、薄层色谱法［45］等。这些方法虽然操作简便，但是灵敏度低，杂质干扰严重，能达到同时分离的有机酸种类较少，因此往往只适用于某些特殊样品或不常见有机酸的分析。

4　葡萄酒有机酸应用展望

了解葡萄酒中有机酸的形成机理以及种类、含量、比例与葡萄酒品质的量化关系，可以为制定葡萄酒质量的评价标准提供参考，也可为指导酿酒生产提供理论依据。葡萄酒有机酸检测作为葡萄酒的重要研究领域，对其进行更广泛的拓展研究具有重要的理论和实际意义。

目前已有研究者将统计学方法、TPCA（主成分分析）等［46］初步应用于葡萄酒质量分析与评价，为葡萄酒有机酸评价体系的建立提供了理论参考，但要为葡萄酒质量控制和品质区分提供更加完善有效的途径，还需进行更深入的实践与应用。

葡萄酒真伪鉴定是当今国内外检验的一个热点。葡萄酒掺假事件已有相关报道，生产者为降低成本，用“三精一水”（酒精、糖精、香精、水）勾兑，再添加一些合成有机酸等成分制成葡萄酒或者将价廉的酒掺假到价钱比较昂贵的酒中以获得高额利润。不同种类葡萄酒的有机酸种类和含量差别较大，在一定条件下，可以尝试通过测定各种有机酸含量来鉴别葡萄酒掺假与否。

有机酸含量除受种植地域、成分和采摘年份的影响外，也受酿造工艺及环境条件等影响。通过研究葡萄酒发酵过程中有机酸的动态变化规律，可以为改进生产工艺和调控葡萄酒品质提供重要依据。但有机酸的发酵变化是一个极为复杂的过程，其含量高低是酵母类型、发酵工艺条件等因素共同作用的结果，还有许多方面尚不清楚，尚待研究者们进一步的研究。

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Research status and application prospects of organic acids in w ine

MO Yan-xia，YIN Ju-yi，GU Xiao-jun，CHEN M ei-zhen，HEW ei-m in，WUW ei-er
（Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Ningbo 315800，China）

Organic constituents was an importantmeans ofexp loring the wine flavor substances and geographical environment，w inemaking，w ine quality relationships.This overview concerned the c lassifying of the organic acids and the changes during fermentation，reviewed the analysis and detection methods of organic acids in w ine.The p rospects of the app lication aboutorganic acids in w ines had been dep icted.

w ine；organic acids；analyticalmethod；app lication

TS261

A

1002-0306（2015）06-0380-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.074

2014-06-17

莫燕霞（1981-），女，硕士研究生，工程师，研究方向：食品检测分析。

宁波市级科技计划项目（2012F1002）。