CdTe为荧光探针测定罗汉参中的混合氨基酸

张修景

（菏泽学院化学与化工系，山东菏泽274015）

CdTe为荧光探针测定罗汉参中的混合氨基酸

张修景

（菏泽学院化学与化工系，山东菏泽274015）

制备一种新型量子点CdTe，建立一种以CdTe为荧光探针测定罗汉参中混合氨基酸的方法。向荧光量子点CdTe溶液中加入Co2+后其荧光强度降低，降低的程度在一定范围内与Co2+浓度成线性关系；加入氨基酸后，荧光强度又得到恢复，而量子点荧光的恢复强度与加入氨基酸的浓度呈线性关系。在混合氨基酸标准溶液2.0×10-8～5.5×10-7mol/L线性范围内，量子点荧光的恢复强度与混合氨基酸浓度的线性方程为y=1.04×106x+1.013，相关系数R2=0.9995。考察了不同缓冲溶液、pH、Co2+浓度等因素对体系造成的影响。结果表明，在pH=9.5的硼砂缓冲溶液中，2.0×10-5mol/L的Co2+能很好的猝灭CdTe荧光。应用于实际样品测定的相对标准偏差（n=5）为3.0%，加标回收率在98.3%～104.4%范围内，检出限为1.1×10-8mol/L。该方法简单、快速，实用性强。

荧光量子点，CdTe，罗汉参，氨基酸

量子点（Quantum dots，QDs），又称为纳米晶，其粒径一般介于1～10nm之间［1］。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激发后可以发射荧光［2］。基于量子效应，量子点在太阳能电池、发光器件、光学生物标记、生物检测和生物成像等领域具有广泛的应用前景［3］。

罗汉参（香芋）产于山东单县。山东大学中心实验室对罗汉参的营养分析表明，罗汉参干物质中富含特殊功能因子抗性淀粉［4］38.2%、粗蛋白17.3%、还原性糖4.2%。且含有较多的纤维素、氨基酸和硒［5］等。通过动物和人体实验罗汉参食后具有降胆固醇，降甘油脂，降血糖［6］；润肠通便，预防便秘［7］；促进肠道毒素的分解和排出，预防胃肠癌的发生等作用。食用则清香甘甜，风味独特。近年来，人们把罗汉参作为保健食品。

氨基酸是“生命的基石”，缺少它会导致夸希奥素病，其表现为贫血、浮肿、胃溃疡、生长停止和大脑活动功能减退等症状［8］。目前，测定氨基酸的方法有分光光度法［9］、分子荧光法［10］、液相色谱法［11］、氨基酸自动检测仪等方法。后两种方法费用相对较高。且氨基酸自动检测仪结构复杂，测定结果受pH影响较大。分光光度法，操作方便，灵敏度有限，检出限不够理想。本文研究了一种荧光猝灭恢复法，先制备量子点CdTe，然后以CdTe为荧光探针测定罗汉参中混合氨基酸的含量。方法准确，检出限低，可以适用于罗汉参等食品中微量氨基酸的检测。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

罗汉参山东单县天祥罗汉参专业合作社生产的华福牌；硝酸钴、氢氧化钠、硼砂、巯基乙酸、Te粉、氯化镉分析纯；L-酪氨酸、L-脯氨酰胺、甘氨酸、L-赖氨酸碱、D-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-白氨酸、L-胱氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸盐酸盐、DL-丝氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-异亮氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-焦谷氨酸生化试剂；实验用水三重蒸馏水。

F-280荧光分光光度计天津港东科技发展股份有限公司；303型电热恒温鼓风干燥箱山东潍坊精鹰医疗器械有限公司；DHT型搅拌调温电热套山东郓城光明仪器中心；分析天平沈阳龙腾电子有限公司；S-4800型高分辨场发射扫描电镜日本日立公司。

1.2实验方法

1.2.1CdTe水溶性量子点的合成制备Te前躯体的制备：在20m L的小烧杯内，加入0.3060g的Te粉，量取6m L水倒入烧杯内，开动磁力搅拌；另取一个20m L小烧杯，称量0.1903g NaBH4放入烧杯内，加入6m L水用玻璃棒搅拌至NaBH4溶解为无色溶液，并将其倒入溶有Te粉的烧杯，并在保持磁力搅拌60℃的条件下反应20m in，得到淡紫色透明的NaHTe溶液，备用。

Cd前躯体的制备：在氮气保护下，向250m L三口烧瓶中，加入100m L水，在磁力搅拌下将1.142g的CdCl2·2H2O溶于水中，然后将0.84m L巯基乙酸加入CdCl2水溶液中，再用1mol/L的NaOH水溶液调节pH为10.00。

CdTe合成：在氮气保护和适当搅拌下将NaHTe水溶液加入Cd前躯体的三口烧瓶中，加热至沸腾后，回流2h。获得棕黄色的CdTe量子点。

1.2.2pH=9.5的硼砂缓冲溶液的配制准确取1.7657g硼砂溶解后，转入100m L容量瓶得0.045mol/L硼砂储备溶液，称取0.8000gNaOH，搅拌溶解后转入100m L容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到0.2000mol/L NaOH溶液，取25.00m L硼砂储备液和8.80m L NaOH溶液于100m L容量瓶，摇匀，定容得pH=9.5的硼砂缓冲溶液。

1.2.3钴离子标准溶液的配制称取0.2910g硝酸钴（分析纯）放入100m L容量瓶稀释至刻度，得0.01000mol/L的钴离子储备液，再分别取一定体积的储备液逐级稀释得到0、2.0×10-6、6.0×10-6、1.0×10-5、2.0×10-5、3.0×10-5mol/L的系列钴离子标准溶液。

1.2.4混合氨基酸标准溶液的配制分别准确称取0.01098g L-酪氨酸、0.006979g L-脯氨酰胺、0.01759g甘氨酸、0.00886g L-赖氨酸碱、0.008067g D-天门冬氨酸、0.009099g L-天冬酰胺、0.007029g L-缬氨酸、0.01238g L-色氨酸、0.008010g L-白氨酸、0.01456g L-胱氨酸、0.009043g L-蛋氨酸、0.01056 L-精氨酸盐酸盐、0.009642 DL-丝氨酸、0.01001g DL-苯丙氨酸、0.007950g DL-异亮氨酸、0.008909g D-谷氨酸、0.006979g D-脯氨酸、0.007825g D-焦谷氨酸置于100m L烧杯中，加适量水，适当加热，搅拌使之完全溶解，冷却后，溶液转入500m L容量瓶中定容，摇匀，得1.20×10-4mol/L混合氨基酸标准储备液。取上述溶液3.34m L于100m L容量瓶中，稀释定容后得到4.00× 10-6mol/L混合氨基酸标准稀释液。分别取不同量的标准稀释液（0、1.00、3.00、5.00、7.50、11.00、15.00m L）于7个100m L的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到0、4.0×10-8、1.2×10-7、2.0×10-7、3.0×10-7、4.4×10-7、6.0×10-7mol/L的系列混合氨基酸标准溶液。

1.2.5样品制备取罗汉参两个，用蒸馏水洗净，于30℃干燥箱内烘5h后，取出，在分析天平上称量得其质量为29.3600g，用不锈钢刀切碎之后，再用150m L的10%CH3COOH研磨成匀浆，提取氨基酸，由于鲜罗汉参中的蛋白质酶能水解蛋白质，造成游离的氨基酸含量升高，故研磨要在冰水浴中进行，又因为罗汉参果肉中的脂类、蛋白质、糖类等易析出，需要加入100m L 95%的乙醇试剂放置一夜除去沉淀，然后抽滤以除去蛋白质，最后用乙酸乙酯萃取除去脂类，转移至250m L容量瓶，定容即可获得含有混合氨基酸的试液。

1.2.6分析方法取6支5m L的比色管，分别加入0.50m L的CdTe，再分别加入0.50m L不同浓度的Co2+溶液，用pH=9.5的硼砂缓冲溶液定容，放置5.00m in，于λex=400nm处测定荧光强度IF。分析求得合适的Co2+浓度，用来猝灭CdTe量子点的荧光。

于7支5m L的比色管中分别加入0.50m L的CdTe，0.50m L上述求出的合适浓度的Co2+溶液，分别加入1.00m L不同浓度的氨基酸标准液，用pH=9.5的硼砂缓冲溶液定容，放置5.00m in，于λex=400nm处测定荧光强度IF，制得氨基酸标准曲线。

于6支5m L的比色管中分别加入0.50m L的CdTe，0.50m L上述求出的合适浓度的Co2+溶液，各自加入1.00m L稀释的样品溶液，用pH=9.5的硼砂缓冲溶液定容，放置5.00m in，于λex=400nm处测定荧光强度IF，按照氨基酸标准曲线及线性方程，计算样品中氨基酸的含量。

2　结果与分析

2.1CdTe量子点的光学性质分析

对合成的CdTe量子点的形貌通过S-4800型高分辨场发射扫描电镜（FESEM）在20KV电压下观测照片如图1。CdTe量子点的颗粒直径为3～7nm，平均尺寸为5nm，尺寸分布较为均一。

对CdTe量子点从200～760nm做光谱扫描，得最大的吸收峰位于533nm处；并做分子荧光发射光谱得在400nm激发波长下，荧光的最大发射波长为545nm。

图1　CdTe量子点的电子显微镜照片Fig.1　Electronmicrographs of CdTe quantum dots

2.2实验条件的优化

2.2.1体系pH的选择采用pH=9.5的硼砂缓冲溶液可以较好控制酸度，可以使Co2+与CdTe量子点反应，发生很好的猝灭效果，且用该缓冲液定容效果最佳，此时，体系在室温下反应5m in即完成，且至少可以稳定1h以上。

2.2.2仪器参数的选择通过设置不同的参数进行实验，仪器的激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，灵敏度为0.5，增益为1，仪器的激发波长为400nm，发射起始波长为450nm，终止波长为750nm时对体系的荧光强度测量，会得到较好效果。

2.2.3共存物质的影响氨基酸浓度为1.0×10-7mol/L时，在优化实验条件下对多种共存物质进行干扰实验。当相对误差在±5%以内时，各共存物质的允许量为（以10-6mol/L计）：Ca2+（125）、NO2-（200）、NH4+（100）、Hg2+（60）、Cu2+（50）、Mg2+（100）、Fe3+（30）、L-葡萄糖（100）、柠檬酸（100）、D-果糖（120）、淀粉（120）、L-鼠李糖（120）等。

2.2.4Co2+作为猝灭剂其浓度的选择室温下，在CdTe体系中加入等量的由1.2.3配制的系列Co2+标准溶液，根据1.2.6的实验方法来测定，以发射波长为横坐标，荧光强度IF为纵坐标得到的荧光谱图见图2，由图2可以看出：随着加入Co2+浓度的不断增加，CdTe的荧光发生不同程度猝灭，其荧光强度逐渐下降。由于CdTe表面大量的羧基和巯基官能团，与Co2+形成复合物，Co2+与巯基乙酸形成的复合物覆盖在CdTe的表面，并与CdTe发生电子转移，产生了更多的非辐射中心，导致CdTe荧光猝灭，且其猝灭程度与猝灭剂浓度间呈线性关系。本实验选用2.0×10-5mol/L Co2+猝灭量子点的荧光。

图2　Co2+猝灭CdTe的荧光光谱图Fig.2　The fluores spectra of CdTe quenched by Co2+

2.3混合氨基酸对体系中已猝灭的CdTe荧光的恢复

2.3.1加入系列混合氨基酸的恢复现象按照1.2所示的实验方法，在2.2所示的实验条件下，在加入2.0× 10-5mol/L Co2+的CdTe体系中，加入1.2.4配制的一系列氨基酸标准溶液，测定体系的荧光强度，随着加入氨基酸浓度的增大，体系的荧光强度也相应的增大，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到图3。

图3　氨基酸对CdTe荧光的恢复图Fig.3　The recovery of amino acino on CdTe

2.3.2恢复机理探讨因为Co2+可与氨基酸分子中α位羰基氧和氨基氮的配位，形成1∶2的配合物，可将Co2+从量子点表面竞争下来，使得CdTe荧光强度得以恢复。

2.3.3氨基酸的工作曲线按照1.2所示的实验方法，在2.2所示的实验条件下，于加入2.0×10-5mol/L Co2+的CdTe体系中，加入1.2.4配制的一系列氨基酸标准溶液，测定体系的荧光强度，见表1。IF为加入系列标准氨基酸后体系的荧光强度，IF0为空白溶液时体系的荧光强度。

表1　氨基酸标准系列溶液的测定数据Table 1　The determination data of a series of amino acid standard solution

根据表1中的数据，以IF/IF0为纵坐标，氨基酸的浓度为横坐标绘图得工作曲线，混合氨基酸浓度在2.0×10-8～5.5×10-7mol/L范围内与体系的荧光恢复强度呈线性关系，其线性回归方程为y=1.04×106x+ 1.013，相关系数R2=0.9995。

2.4样品分析、精密度和加标回收实验

取1.2.5试液各1m L分别放入5个100m L容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。按照1.2.6中的实验方法，分别测量体系荧光强度IF，其值分别为945.0、950.0、957.9、940.0、927.9；IF0=713.2。则其IF/IF0分别为1.325、1.332、1.343、1.318、1.301。代入曲线方程计算其浓度分别为3.000×10-7、3.067×10-7、3.173×10-7、2.933×10-7、2.856×10-7mol/L，其平均值是3.006×10-7mol/L，罗汉参中含混合氨基酸总量718.3mg/kg，18种氨基酸的平均含量是39.91mg/kg。相对标准偏差（RSD）是3.0%（n=5），可见测定方法的精密度较好。再对样品在相同的实验条件下，各自进行加标回收实验，其结果见表2。

表2　氨基酸的加标回收率实验结果Table 2　The result of amino acid recovery experiment

根据测量值，计算得罗汉参中混合氨基酸的加标回收率在98.3%～104.4%之间。对于空白溶液在相同的实验条件下，测定11次荧光强度，根据（S/N=3）计算得检出限是1.1×10-8mol/L。

3　结论

本文研究了选用CdTe为荧光探针测定罗汉参中的混合氨基酸的方法。测定的罗汉参中含混合氨基酸总量是718.3mg/kg。测定结果准确可靠，测定方法简便，可推广使用。揭示了罗汉参是富含氨基酸的营养食品，对人体健康有很高的食用价值。为人们认识罗汉参提供了科学依据。

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CdTe as fluorescent probe to determ ine the m ixed am ino acids in Luohanshen

ZHANG Xiu-jing
（Chemistry and Chemical Engineering Faculty in Heze College，Heze 274015，China）

A new type of CdTe quantum dots（QDs）was p repared.The method was estab lished to determ ine the m ixed am ino acids in Luohanshen by CdTe as fluorescent p robe.After add ing the Co2+fluorescent quantum dots into the CdTe solution，the fluorescence intensity reduced.The reduced extent had a linear relationship w ith the concentration of Co2+in a certain range.After adding the am ino acids，the fluorescence intensity restored，and the quantum fluorescence intensity was linear w ith the concentration of am ino acids.In the m ixed acids standard solution w ith the linear range of 2.0×10-8mol/L to 5.5×10-7mol/L，the linear equation of the recovery intensity of quantum dots fluorescence and the m ixed acids concentration was y=1.04×106x+ 1.013.The correlation coefficient was R2=0.9995.The influence fac tors on the system caused by the different buffer solution，pH value and Co2+concentration，etc were exam ined.The result showed that，in borax buffer solution w ith pH=9.5，the Co2+solution 2.0×10-5mol/L could be better Cd Te fluorescence.The relative standard deviation used tomeasure the acture samp le（n=5）was 3.0%.The recovery rate was between 98.3%to 104.4%. The detection lim itwas 1.1×10-8mol/L.The method was sim p le，rap id and p ractical.

QDS；CdTe；Luo han shen；am ino acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0062-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.004

2014-06-17

张修景（1957-），男，本科，副教授，研究方向：谱学分析与食品的测定研究。

山东省“十二五”重点学科应用化学资助项目（2011350-1）。