马齿苋总黄酮的提取纯化工艺研究

2015-10-19陈国妮孙飞龙闫亚茹

中国饲料 2015年23期

陈国妮，孙飞龙，闫亚茹

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048）

马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生草本植物，含有丰富的营养成分，尤其是活性成分中的黄酮，具有较强的抗菌、抗氧化和抗癌等多种药效功能（金兰和陈宇杰，2010）。

目前，已见报道的提取马齿苋黄酮的方法主要有溶剂提取、超声波辅助提取和微波辅助提取等（吴现芳等；2013；吴昊等；2012；李杏元和陈国安；2012），但这些方法均存在提取效率不高、低耗能和对有效成分造成不良影响等不足。本试验采用响应面分析方法对微波辅助提取马齿苋黄酮进行研究，确定其最佳工艺，同时采用大孔吸附树脂进行纯化工艺研究，为其生物功能的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器马齿苋：采自西安市市郊。无水乙醇、氨水、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸，均为分析纯；大孔吸附树脂AB-8、D101、D3520、HPD300、HPD600、聚酰胺，均为分析纯。

立式电热鼓风干燥箱（DGF-1AB型，天津市泰斯特仪器有限公司）、电子天平 [AL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、紫外可见分光光度计（752N型，上海精密科学仪器有限公司制造）、旋转蒸发器（申科R-205型，上海申顺生物科技有限公司）、微波炉（KD21C-C2型，顺德市美的微波炉制造有限公司）、多功能粉碎机（XS-04型，上海兆申科技有限公司）、循环水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）型，巩义市英峪予华仪器厂]。

1.2 方法

1.2.1 原料的预处理马齿苋除去残根杂质，洗净，自然阴干后置于65℃烘箱中烘干。取出，用多功能粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

1.2.2 马齿苋黄酮的提取与测定

1.2.2.1 马齿苋黄酮的提取称取马齿苋干粉1.0 g放入250 mL锥形瓶中，加入30 mL 95%乙醇，在室温下浸泡并摇匀，在50 W的微波炉中加热10 min。用真空泵抽滤处理后的马齿苋乙醇提取液，滤液用旋转蒸发器浓缩（温度70℃），获得马齿苋黄酮浓缩液，密封保存（翟硕莉，2012）。

1.2.2.2 黄酮定性检测将提取液点于滤纸片上，置于氨水瓶口，显微黄色，移开滤纸片数分钟后，微黄色又消褪，证明该提取物中含有黄酮存在（Chen 和 Yu，2002）。

1.2.2.3 马齿苋总黄酮得率计算取芦丁标准品10 mg，用70%乙醇定容于10.0 mL容量瓶，配成标准溶液，根据祁英等（2010）比色法测定并绘制标准曲线。在波长510 nm下测其吸光度，带入标准曲线方程，计算出总黄酮的浓度，按公式计算总黄酮提取率。根据标准品芦丁浓度C（g/L）与吸光度A绘制标准曲线，方程如下：

式中：Y为总黄酮得率，mg/g；C为吸光度为A时由标准曲线方程计算出样品液的质量浓度，g/L；V为样品液的体积，mL；m为称取样品的质量，g。

1.2.3 响应面法优化马齿苋中总黄酮的提取条件在单因素试验的基础上，采用中心组合Box-Behnken（Yamazaki等，1987）设计方案，采用响应面法分析各因素对因变量总黄酮得率的影响，并优化其提取条件。因素与水平见表1。

表1 中心组合Box-Behnken试验的因素与水平

1.2.4 大孔吸附树脂分离纯化马齿苋总黄酮

1.2.4.1 树脂预处理首先用蒸馏水浸泡树脂，放置24 h；然后沥干蒸馏水，依次加入适量浓度的盐酸和氢氧化钠溶液浸泡；数小时后，再用蒸馏水对树脂进行反复冲洗，用pH试纸测其酸度，直到中性为止。洗涤完后，进行动态洗脱，上柱加入一定量体积90%的乙醇溶液，乙醇洗脱完之后，加蒸馏水将残留的乙醇洗脱干净，若洗脱液不澄清，则继续洗脱。

1.2.4.2 静态饱和吸附解析试验本试验选取了 AB-8、D101、D3520、HPD300、HPD600、聚酰胺等几种不同树脂进行上柱层析。先分别称取2 g预处理的大孔吸附树脂，置于100 mL的锥形瓶中，精确加入马齿苋黄酮提取液，持续摇荡24 h，过滤。将滤过的树脂另置于100 mL的容量瓶，加入80%的乙醇10 mL，继续摇荡，过滤。按照1.2.2.3的方法测其吸光度，计算吸附率与解析率。

式中：A0为初始液吸光度值；A1为吸附液吸光度值；A2为洗脱液吸光度值。

1.2.4.3 马齿苋提取物中总黄酮纯度的测定将纯化前、后的马齿苋黄酮提取物浓缩制成浸膏，再依次加入适量乙醇进行溶解、稀释，前后溶液稀释倍数为10和50。然后用分光光度法平行测其吸光度3次，求平均值。提取物中的总黄酮纯度计算公式为：

式中：C为马齿苋总黄酮的纯度，%；n为稀释倍数；A为测得黄酮的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 响应面法优化马齿苋中总黄酮的提取条件采用Box-Behnken进行试验设计，设计及结果如表2所示。以微波时间（Z1）、乙醇浓度（Z2）以及微波功率（Z3）为自变量，总黄酮得率（Y）为响应值，采用desinger expert软件对响应面分析。响应值（Y）与自变量 Z1、Z2、Z3拟合得到响应面的二次方程为：

2.2 响应面试验结果分析由表3可知，模型中一次项Z1、Z3为显著，Z2为极显著，二次项为显著为极显著；整体模型的显著水平P＜0.01，表明该模型极显著。Pred（R2）为 0.9561，而Adj（R2）是 0.8770，说明拟合的模型方程较好，该模型可以用来指导试验。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型方差分析及结果

2.3 各因素相互作用对总黄酮得率的影响微波时间（Z1）、乙醇浓度（Z2）、微波功率（Z3）三因素对提取率（Y）的响应面图见图1。

从响应面3D图的最高点和等值线可以看出，有极值存在于所选范围内，是响应面的最高点，也是等值线最小椭圆的中心点；从响应面图的陡势可直观看出，微波时间与功率相互作用的曲面变化显著，即对总黄酮得率影响最大。

图1 各因素对提取率影响的响应面图

2.4 最佳提取工艺确定通过Design Expert软件得到的最优提取工艺条件为：微波时间9.15 min、乙醇浓度78.68%、微波功率391.52 W，理论得率为21.8129 mg/g。实际的最佳提取工艺条件为：微波时间10 min、乙醇浓度75%、微波功率400 W，实际所得结果为21.2592 mg/g。此结果与理论预测值接近，说明响应面法可用于优化马齿苋黄酮微波提取工艺，准确可靠，实用性较高。

2.5 树脂型号的选择由表4可以看出，不同型号的树脂，在相同条件下其吸附与解析能力均有所区别。D101、HPD300、HPD600和聚酰胺的吸附率较高，均达到了70%以上，而 D3520、HPD300、HPD600的解析率较好，综合分析各树脂对黄酮的吸附与解析能力，HPD600树脂吸附率达到了80.40%，解析率为81.70%，所以选取HPD600树脂为最佳填料，进行后续的试验。

2.6 动态试验结果通过进行大量的纯化试验，确定HPD600树脂的纯化工艺，最终确定的最佳纯化工艺条件：马齿苋黄酮上样浓度为15 mg/mL，上样量为2 BV，洗脱剂浓度为80%乙醇，洗脱剂用量3 BV。在该条件下由1.2.4.3公式计算，得到纯化后的黄酮纯度为81.87%，约是纯化前20.35%的近4倍左右。