猪Lp-PLA2多克隆抗体制备

侯小强

（北京军区总医院中心实验科，北京东城 100700）

脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）又称血小板活化因子乙酰水解酶，是钙离子非依赖性的磷脂酶（Larsson等，1999）。Lp-PLA2主要由单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞产生和分泌（Hakkinen等，1999）。研究表明Lp-PLA2通过短的sn-2酯键作用于磷脂的水溶部分，产生两种炎症介质：溶血卵磷脂（lyso-LPC）和氧化的非酯化脂肪酸（oxNE-FAS），均具有很强促炎症反应特征（Shi等，2007）。 此外，促炎因子 IL-6、TNF-α 也能促进Lp-PLA2的表达，并且使其活性增加，形成促炎循环（Li等，2015）。炎症在哺乳动物疾病发生发展和病毒传播过程中扮演重要角色（Czarzasta和Jana，2013；Go·khan，2006）。研究猪Lp-PLA2与炎症的关系将有助于利用动物模型猪研究炎症性疾病。但目前猪的Lp-PLA2抗体制备研究鲜见报道。因此，本研究构建了猪Lp-PLA2原核表达载体，并进行诱导表达及条件优化，最终获得大量猪Lp-PLA2纯化蛋白质，使用该蛋白质制备了多克隆抗体，并对该多克隆抗体的功能进行检测。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及主要试剂 PET-28a质粒、BL21菌种为本室保存。 NheI、XhoI、T4 DNA 连接酶 、Protein marker购 自 Fermentas 公 司 ；2×Taq Plus PCR MasterMix、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）、TRNzol-A+总RNA提取试剂、DNA MarkerⅢ和D15000均购自TIANGEN公司；Biospin质粒DNA小量提取试剂盒、BioRT cDNA第一链合成试剂盒购自BIOER公司；Ni-NTA树脂纯化蛋白质试剂盒购自Thermo公司；硝酸纤维素（NC）膜购自BOSTER公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自sigma公司。

1.2 目的基因的获得和扩增 使用TRNzol-A+提取猪单核细胞总RNA，用BioRT cDNA第一链合成试剂盒进行反转得到cDNA，以cDNA为模板扩增目的基因Lp-PLA2。PCR反应总体系（25 μL）： 模板 1 μL （50 ng），2×Taq plus master mix 12.5 μL， 上游引物和下游引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR 反应条件：94 ℃ 3 min， 然后 94 ℃30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸5 min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳30 min，得到1317 bp目的条带，进行目的条带回收，-20℃保存备用。

1.3 表达质粒的构建 将PET-28a质粒载体和回收的目的片段用NheI和XhoI酶切之后进行连接。将连接产物转化到BL21菌种中，均匀涂在含LB固体培养基的平板上，37℃培养。挑取单菌落，在液体LB培养基扩大培养，用Biospin质粒DNA小量提取试剂盒小量提取重组质粒。用NheI和XhoI酶对重组质粒进行酶切鉴定得到片段5369 bp和1317 bp，并进行DNA序列测定，确定质粒构建正确。

1.4 目的蛋白的诱导表达及条件优化 诱导表达：将菌种按1%接种到含Kan抗性的LB液体培养基中，37℃培养至细胞OD600为0.5～0.8（2～3 h）时，用一定浓度的IPTG在适当温度下诱导6～12 h，离心收集菌体，超声破碎，分别取上清和沉淀做SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。如在上清中检测到目的蛋白过表达，则为可溶性蛋白，反之则为包含体。

条件优化：分别用 0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTG在不同温度（16、20、28、37 ℃）下诱导菌体表达目的蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测上清和沉淀中目的蛋白的表达。确定其表达的最佳IPTG诱导浓度和温度。

1.5 重组Lp-PLA2蛋白纯化 大量诱导表达并收集菌体，超声破碎，取沉淀得到含包含体的菌体蛋白，将沉淀溶于含8 mol/L尿素的Tris-Hcl缓冲液中进行亲和层析纯化。Ni-NTA树脂亲和层析纯化蛋白：5倍柱体积20%乙醇洗柱子，5倍柱体积水洗，10倍柱体积平衡液平衡；上样；5倍柱体积洗涤液洗涤，不收集；20倍柱体积洗脱液洗脱，收集；10柱体积平衡液处理；5倍柱体积水洗柱子，5倍柱体积20%乙醇洗柱子，最后用20%乙醇将柱子浸泡，4℃保存。

1.6 抗血清的制备及检测 将纯化的Lp-PLA2蛋白作为抗原免疫家兔，免疫前各兔留取耳缘静脉血2 mL，待分离血清作阴性对照。经耳缘静脉免疫家兔，每次注射抗原浓度均为800～1000 ng，首次加完全弗式佐剂注射混合乳化，以后加不完全弗式佐剂注射混合乳化，共注射4次，每次间隔14 d。每次注射前耳缘静脉取血，分离血清进行抗体检测。末次注射后第7天，心脏取血，分离血清分装并进行抗体检测。

2 结果

2.1 猪Lp-PLA2原核表达质粒的构建和鉴定

根据 NCBI中猪 Lp-PLA2序列（NM_001113013）设计引物，以猪血液单核细胞cDNA为模板，进行PCR扩增，获得条带大小为1317bp的猪Lp-PLA2片段（图1），连接到原核表达载体PET-28a中，并进行酶切鉴定和测序验证（图2）。结果显示，成功获得了猪Lp-PLA2原核表达载体。

图1 猪Lp-PLA2 PCR扩增结果

图2 猪Lp-PLA2原核表达质粒双酶切鉴定

2.2 猪Lp-PLA2的诱导表达条件优化和鉴定将Lp-PLA2转化进入BL21细胞中，在不同温度（16、20、28、37 ℃） 下，用不同浓度的 IPTG（0.5、0.75、1 mmol/L）进行诱导表达，并分别对菌体和上清进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达量。结果显示，在37℃、1 mol/L IPTG诱导条件下，菌体中Lp-PLA2以包含体形式表达量最高（图3和图4）。

2.3 猪Lp-PLA2的表达与纯化 对猪Lp-PLA2进行大量诱导，条件为37℃、IPTG 1 mmol/L。将获得的菌体超声破碎，然后用 Ni-NTA树脂进行亲和层析纯化，并进行SDS-PAGE鉴定（图5）。结果显示，本试验成功获得猪Lp-PLA2蛋白。

图3 不同浓度IPTG诱导Lp-PLA2表达

图4 不同温度IPTG诱导Lp-PLA2表达

图5 猪Lp-PLA2蛋白纯化结果

2.4 Lp-PLA2多克隆抗体制备和检测 将纯化的猪Lp-PLA2蛋白质作为抗原，免疫兔子，在一定时间内对血清进行免疫检测。分别以诱导表达的菌体蛋白和猪单核细胞总蛋白为抗原检测抗体（图6和图7）。结果显示，获得的猪Lp-PLA2抗体既能够与自身抗原产生免疫反应，也能检测猪体组织中Lp-PLA2的表达。

图6 菌体蛋白验证猪Lp-PLA2多克隆抗体

图7 猪Lp-PLA2多克隆抗体的检测

3 讨论

Lp-PLA2是新近发现的炎症相关因子，研究Lp-PLA2的功能和调节机制具有重要意义。因此，本研究制备的猪Lp-PLA2抗体有助于研究猪体内Lp-PLA2与炎症的关系，并为利用猪作为动物模型研究疾病防控提供理论依据。

[1]Czarzasta J，Jana B.Inflammation changes the expression of leukotriene receptors in porcine uteri[J].J Reprod Immunol，2013，100（2）：93～103.

[3]Hakkinen T，Luoma J S，Hitumen M O，et al.Lipoprotein-associated phospholipase A （2），platelet-activating factor acetylhydrolase，is expressed by macrophagesin human and rabbitatherosclerotic lesions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19（12）：2909～17.

[4]Larsson F P，Kennedy B P，Claesson H E.The human calcium-independent phospholipase A2 gene multiple enzymes with distinct properties from a single gene[J].Eur J Biochem，1999.262（2）：575～85.

[5]Li Z，Ren W，Han X，et al.ω3-polyunsaturated fatty acids suppress lipoprotein-associated phospholipase A2 expression in macrophages and animal models[J].Mol Nutr Food Res，2015.doi：10.1002/mnfr.201500022.

[6]Shi Y，Zhang P，Zhang L F，et al.Role of lipoprotein-associated phospholipase A2 in leukocyte activation and inflammatory responses[J].Atherosclerosis，2007，191（1）：54～62.