红曲霉-人参双向固体发酵产物成分变化的初步分析

厍守权， 刘 刚， 李 妍， 金美松， 孙卫平， 康东周

（延边大学药学院，吉林　延吉　133002）

红曲霉-人参双向固体发酵产物成分变化的初步分析

厍守权， 刘 刚， 李 妍， 金美松， 孙卫平， 康东周*

（延边大学药学院，吉林延吉133002）

目的 利用TLC和HPLC定性分析红曲霉-人参粉末双向固体发酵产物主要成分的变化。方法 红曲霉接种于以人参为发酵基质的固体培养基。取人参和人参发酵产物的甲醇提取液，TLC测定它们的酸式monacolin K，HPLC法测定其人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rg3。结果 人参经过红曲霉发酵后，TLC检测出活性成分酸式monacolin K，HPLC证实了人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含有量降低，但发酵液中出现人参皂苷Rg3。结论 红曲霉-人参粉末双向固体发酵使人参皂苷转化成稀有的人参皂苷Rg3，并保存红曲霉中的酸式monacolin K.

红曲霉；人参；发酵；TLC；HPLC；酸式monacolin K；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；人参Rg3

红曲霉是药食两用真菌，在我国的应用已有千年的历史［1-2］。红曲霉拥有强大的酶系［3］，在生长过程中能够产生次级代谢产物monacolin K，1979年日本学者远藤章从红曲酶发酵液中分离得到［4-5］，并发现其为HMG-CoA还原酶的抑制剂，能够抑制胆固醇的生物合成［6］。科学家们经过大量试验证明monacolin K在降低胆固醇方面具有高效、低毒、安全等特点。

人参享有“中药之王”的美称，被人类应用于药物治疗方面已有上千年的历史。人参皂苷是人参的主要药用活性成分之一［7-8］，尤其是人参皂苷Rg3和Rh2具有很强的促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、保肝、增强免疫力和保护心血管的作用。但是Rg3和Rh2这种稀有人参皂苷在人参中含有量极低［9］。

现阶段，微生物发酵转化中药的研究成为热点，其具有改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症等特点［10］。二十世纪80年代末，“药用真菌新型（双向性）固体发酵工程”简称“双向发酵”正式问世［11］。机理是采用不同的中药材组成不同的“药性基质”的底物，在现代生物技术严密控制下，通过接种不同的单株药用真菌，发生一系列复杂的生理活动与生化反应。这样的组合既提供了真菌生长所需的营养，也能使药性基质的成分和组织分解、变化，并产生新的成分，得到的发酵终产物兼具药用真菌和中药材的功效，最终使发酵作用演变成双向性［12-14］。本实验利用药用真菌红曲霉菌固体发酵人参，为红曲霉-中药材双向发酵体系药用价值的深层次挖掘和开发奠定基础，同时为中草药的二次开发提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1供试材料 人参，购于延边参茸总公司，由延边大学药学院吕慧子副教授鉴定为人参Panaxginseng C.A.Mey的根部；红曲酶菌株，由韩国KCCM提供。

1.1.2药品试剂 Monacolin K对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号100600-201102），人参皂苷对照品Rg1（批号110703-200726），Re（编号110804），Rb1（批号110704-200420）由中国药品生物制品检定所提供，Rg3（中国食品药品检定研究院提供，批号110754-201123）；甲醇、乙腈（色谱级，Fisher Scientific）；正丁醇、三氯甲烷、石油醚、苯、浓硫酸、无水乙醇、甲酸均为分析纯。

1.2仪器与设备 HITACHI-2000型高效液相色谱仪（日本日立公司）；FA604型电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；YQ-620B型超声波清洗机（上海易净超声波仪器有限公司）；HZQ-F100型振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；DNP-9162BS-III型电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；SW-CJ-IC型净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）；DSX-280B型不锈钢手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.3方法

1.3.1红曲霉发酵人参 在超净工作台上，将红曲菌种转接于斜面培养基上，30℃下培养7 d。将培养好的斜面菌种转接于摇瓶种子培养液中，放入摇床培养箱中，在一定温度和转数下培养48 h。取一定量的摇瓶种子液，接种于以人参为发酵基质的固体培养基上，置于恒温培养箱中，一定温度下培养若干天。

1.3.2TLC法检测发酵产物中的monacolin K 取适量monacolin K对照品2份，用甲醇配制成0.1%的溶液，为内酯式monacolin K对照品溶液，加入适量0.1 mol/LNaOH-75%乙醇［15］，60℃水浴2 h，得酸式monacolin K对照品溶液。再取适量发酵产品，按固液比1∶10加蒸馏水，放入振荡培养箱中，30℃，150 r/min振荡3 h。振荡结束后离心10 min，弃上清液，得残渣。干燥残渣再按固液比1∶20加入石油醚，70℃回流提取90 min，之后离心10 min，弃上清液，得残渣。干燥残渣再按固液比1∶20加入甲醇，70℃回流提取4 h，之后提取液离心，取上清液，浓缩至适量，得供试品溶液。取TLC板，105℃活化45 min，待冷却后，取供试液与对照品溶液在TLC板上同时展开，展开剂为苯-甲醇-三氯甲烷-甲酸（24∶2∶2∶0.5），展开结束后吹干，用10%硫酸-乙醇显色，观察效果。

1.3.3TLC法检测发酵产物中人参皂苷的成分变化 分别取人参皂苷Rg1、Rg3对照品1 mg加入1 mL甲醇溶解，配制成对照品溶液。再分别取干人参和人参发酵产物适量，加入适量甲醇，超声提取3 h，之后离心，取上清液。蒸干上清液，残渣用适量蒸馏水溶解，并加入等体积的水饱和正丁醇进行萃取，取上层液体与对照品溶液同时在TLC板上展开，展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10），10℃下放置分层的下层液体［16］。展开结束后吹干，用10%硫酸-乙醇显色，观察效果。

1.3.4HPLC法测定发酵产物中人参皂苷的成分变化

1.3.4.1色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相为乙腈-1.3%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～30 min，乙腈19%；30～35 min，乙腈19%～24%；35～80 min，乙腈24%～50%），体积流量为0.8 mL/min，柱温为30℃，检测波长为203 nm，进样量为20μL。

1.3.4.2对照品的制备 将人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg3对照品分别用甲醇配制成1 mg/mL的对照品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，用于HPLC检测。

1.3.4.3供试液的制备 分别取干人参和人参发酵产物适量，加入适量甲醇，超声提取3 h，之后离心，取上清液。蒸干上清液，残渣用适量蒸馏水溶解，并加入等体积的水饱和正丁醇进行萃取，萃取后取上层液体，将所取上层液体蒸干后溶于适量的色谱级甲醇中，0.45μm微孔滤膜过滤，用于HPLC检测。

2　结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1精密度试验 精密吸取Rg3对照品溶液20 μL，按照色谱条件进行HPLC测定，连续进样6次，记录峰面积，人参皂苷Rg3的峰面积RSD值为0.8%，小于5.0%，表明所用仪器的精密度良好。

2.1.2稳定性试验 精密吸取Rg3对照品溶液20 μL，按照色谱条件进行HPLC测定，分别在0、4、8、12、24、48 h后连续进样，记录峰面积，人参皂苷Rg3的峰面积RSD值为1.1%，表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.1.3重复性试验 分别精密吸取20μL Rg3对照品溶液6份，按照色谱条件分别进样，进行HPLC测定，记录峰面积，人参皂苷Rg3的峰面积RSD值为1.8%，小于5.0%，表明该方法重复性良好。

2.2TLC法对发酵产物中monacolin K的定性分析结果 如图1所示，发酵样品与内酯式和酸式monacolin K对照品相比较，酸式monacolin K对照品的斑点明显可见，说明红曲酶-人参发酵产物中含有酸式monacolin K。

2.3TLC法对发酵产物中人参皂苷的定性分析结果 如图2所示，发酵人参样品与Rg3在相同的Rf值处有斑点出现，而未发酵人参则没有斑点出现，初步证明发酵人参当中含有人参皂苷Rg3。

2.4HPLC法对发酵产物中人参皂苷的定性分析结果 根据图3，色谱峰1、2分别为人参皂苷Rg1、Re色谱峰，色谱峰5为人参皂苷Rb1色谱峰，色谱峰Rg3为色谱峰9。人参皂苷Rg1、Re、Rb1在发酵中发生转化，含有量降低，人参经过发酵得到人参皂苷Rg3，其转化机制尚待研究。从HPLC图还可看出其他色谱峰高略有变化，具体化学成分有待进一步研究。

图1　红曲样品的TLC图谱Fig.1 TLC chromatogram of Monascus product

图2　人参样品TLC图Fig.2 TLC chromatogram of Ginseng

3　讨论

对红曲霉所产生的monacolin K定性分析检测。由于monacolin K在酸性条件下以酸式和内酯式两种形式存在，他们处于一种相互转化的动态平衡中［17］，两者的结构只是在母核上两处支链结构有微小区别，而且两者的极性极其相近，利用高效液相色谱法对monacolin K进行检测时，两者在相同波长处的峰在同一处不易分开，这就为其定性造成了一定的困难。所以利用薄层色谱法对monacolin K定性，但对色谱系统的要求也很高，需要找出合适的展开剂种类及展开比例，以达到内酯式mona-colin K和酸式monacolin K的良好分离。

图3　人参HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograph map of Ginseng

人参皂苷的变化是由于微生物在生长过程中产生的酶对人参皂苷的某一部位或某几个部位的特定转化而获得一定的产物［18］。本实验中利用红曲霉发酵人参，根据TLC和HPLC图谱可知人参皂苷发生了转化，并成功转化出人参稀有皂苷Rg3，转化机理可能为人参皂苷Rb1经过酶的水解作用在C20位脱去一个葡萄糖苷生成人参皂苷Rd，再经进一步水解生成人参皂苷Rg3［19］如图4所示。或者人参皂苷Rb2和Rc在不同的酶的作用下改变了C3和C20上的糖链结构最终转化成人参皂苷Rg3［20］，如图5所示。具体的转化路线还有待于进一步的研究考证。

从结果中可以得出，发酵产物中检测出活性成分酸式monacolin K和人参稀有皂苷Rg3，发酵产物兼具红曲霉和人参主要活性成分，红曲霉具有一定的转化人参皂苷的能力，人参皂苷成分发生变化，并转化出人参皂苷Rg3，使发酵具有双向性。

图4　人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rg3反应机理图Fig.4 Reaction mechanism of ginsenoside Rb1converted into Rg3

图5　人参皂苷Rb2和Rc转化为人参皂苷Rg3的反应机理图Fig.5 Reaction mechanism of ginsenoside Rb2and Rc converted into Rg3

［1］ 傅金泉.中国古代红曲文化及现代新技术［J］.酿酒科技，2001（1）：79-80.

［2］ 邢旺兴，宓鹤鸣，贺 祥.红曲考证［J］.中药材，2000，23（3）：175-177.

［3］ 荆雯雯.红曲霉双向发酵体系的初步研究［D］.贵阳：贵州大学，2011：6.

［4］ Endo A.Monacolin K-A new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species［J］.JANTIBIOT，1979，32（8）：852-854.

［5］ Endo A.Monacolin K-A new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits3-hydroxy-3-methylglu-laryl coenzyme A reductase［J］.JANTIBIOT，1980，33（3）：334-336.

［6］ 王 玲，吴军林，吴清平.红曲降血脂功能的研究及应用概况［J］.食品工业科技，2014，35（8）：387-389.

［7］ 郭秀丽，高淑莲.人参化学成分和药理研究进展［J］.中医临床研究，2012，4（14）：26-27.

［8］ 黎 阳，张铁军，刘素香，等.人参化学成分和药理研究进展［J］.中草药，2009，40（1）：164-附2.

［9］ Yu H S，Liu QM，Zhang C Z，etal.A new ginsenosidase from Aspergillus strain hydrolyzing 20-O-multi-glycoside of PPD ginsenoside［J］.Process.Biochemistry，2009，（7）：772-775.

［10］ 邬吉野.槐耳大黄双向发酵研究［D］.北京：北京中医药大学，2013：10-11.

［11］ 庄 毅，潘 扬，谢小梅，等.药用真菌双向发酵的起源、发展及其优势和潜力［J］.中国食用菌，2007，26（2）：3-6.

［12］ 魏 龙，贠建民，艾对元，等.提高灵芝-当归双向固态发酵基质抗氧化活性的条件优化研究［J］.食品工业科技，2014：1-8.

［13］ 崔培梧，吴红娟，谭朝阳，等.植物药-茯苓菌双向发酵代谢特征初探［J］.湖南中医药大学学报，2013，33（7）：37-40.

［14］ 张 婧，郭明晔，程亦雄，等.响应面法优化槐耳/板蓝根双向发酵条件［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（22）：34-37.

［15］ 杨 丽，张水华，王启军.TLC薄层色谱法同步检测功能红曲中酸性和内酯型莫那呵啉K（Monacolin K）［J］.食品研究与开发，2006，27（2）：113-114.

［16］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：8.

［17］ Wang Q J，Zhang SH，Sung C K，et al.Simultaneous detection of lactone form and acid form monacolin K by sensitive TLC method［J］.Journal of South China Uniυersity of Technology（Natural Science Edition），2003，31（9）：71-74.

［18］ 宋学洲，高文斌，郑毅男.人参皂苷生物转化研究最新进展［J］.人参研究，2012，24（1）：34-38.

［19］ 王洪峰，朱 凯，田 健，等.人参双向固体发酵过程中化学成分的变化［J］.吉林农业大学学报，2013，35（3）：312-316.

［20］ 白龙律.人参皂苷微生物转化研究［D］.北京：延边大学化学院，2011：10-11.

Chem ical changes in M onascus-Ginseng product after bi-directional solid fermentation

SHE Shou-quan， LIU Gang， LIYan， JIN Mei-song， SUNWei-ping， KANG Dong-zhou*
（College of Pharmacy，Yanbian Uniυersity，Yanji133002，China）

AIM To analyze the constituent changes in the products ofmedicinal fungi Monascus and Ginseng powder after the bi-directional solid fermentation by TLC and HPLC.METHODS By inoculating Ginseng powder with Monascus，TLC was used tomeasure the acid form monacolin K content and the contents of ginsenoside Rg1，Re，Rb1，and Rg3ofmethanolic extracts were determined from Ginseng and Ginseng fermented broth by HPLC. RESULTS The TLC showed that therewas acid form monacolin K contained in Monascus-Gnseng fermented product.HPLCmethod proved thata slight decrease in contents of ginsenosides Rg1，Re and Rb1，but ginsenoside Rg3appeared in Ginseng fermented broth.CONCLUSION Monascus-Ginseng bi-directional solid fermentationmakes ginsenosides convert to ginsenoside Rg3which is rare in Ginseng and does not destroy acid form monacolin K from Monascus in fermented broth.

Monascus；Ginseng；fermentation；TLC；HPLC；acid form monacolin K；ginsenoside Rg1；ginsenoside Re；ginsenoside Rb1；ginsenoside Rg3

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.030

2014-04-12

厍守权（1986—），男，硕士生，研究方向为功能保健食品。Tel：13199540256，E-mail：327719006@qq.com

康东周，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为功能保健食品。Tel：（0433）2436012

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0599-05