苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠的治疗作用

段贤春， 汪永忠， 方朝晖， 吴 健， 高家荣， 罗 欢， 夏伦祝

（安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽　合肥　230031）

苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠的治疗作用

段贤春， 汪永忠， 方朝晖*， 吴 健， 高家荣， 罗 欢， 夏伦祝

（安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031）

目的 观察苁归益肾胶囊（肉苁蓉、当归、山茱萸、桂枝、泽泻、丹皮）对糖尿病肾病模型大鼠的治疗作用。方法 120只SD大鼠随机分为6组，苁归益肾胶囊高、中、低剂量组，厄贝沙坦阳性对照组，模型组和正常组，每组20只。采用STZ腹腔注射建立糖尿病肾病大鼠模型。分组造模后灌胃给药4周，检测空腹血糖、24 h尿微蛋白量、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、肾组织血管紧张素Ⅱ受体1（AT1R）、血管紧张素Ⅱ受体结合蛋白（AGTRAP）、结缔组织生长因子（CTGF）的表达等指标。结果 经苁归益肾胶囊治疗4周后，大鼠24 h尿蛋白、空腹血糖及AngⅡ的水平均明显低于模型组（P＜0.05）。结论 苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠有一定的治疗作用，其可能机制是抑制了大鼠的炎症反应，与抑制大鼠肾组织中AT1R、AGTRAP、CTGF的表达，降低AngⅡ的水平有关。

苁归益肾胶囊；糖尿病肾病；血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）；血管紧张素Ⅱ受体1（AT1R）；血管紧张素Ⅱ受体结合蛋白（AGTRAP）；结缔组织生长因子（CTGF）；大鼠

苁归益肾胶囊是安徽中医药大学第一附属医院的医院制剂，是治疗糖尿病肾病的有效方，具有温阳、滋阴、固肾之功效，在临床上常用于治疗糖尿病并发症。

本研究通过动物实验观察苁归益肾胶囊对糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的治疗作用，为其新药研发和临床应用奠定基础。

1　实验材料

1.1实验动物 成年SD大鼠，120只（60只雌性大鼠和60只雄性大鼠），体质量200～250 g，大鼠身体健康，毛色正常，无生病、残疾、细菌感染等病态情况。实验前期，将大鼠进行适应性饲养1周，实验期间饲喂颗粒饲料、自由饮水。

饲养环境：动物房为12 h光照、12 h黑暗，相对湿度为50%～70%，室温为18℃～22℃。

1.2实验药物 苁归益肾胶囊，由本院制剂中心提供，生产批号20130925。处方组成包括肉苁蓉、当归、山茱萸、桂枝、泽泻、丹皮等。具温阳滋阴固肾之作用，用于治疗阴阳两虚之消渴病。每瓶装胶囊36粒，每粒装药0.4 g，临床用法用量：口服，成人1次3～5粒，每日3次。

厄贝沙坦片（即阳性对照药），商品名为吉加，江苏恒瑞医药股份有限公司提供，产品批号12082951，规格0.15 g/粒，适应症：高血压病。用法用量：口服，推荐起始剂量为0.15 g，1日1次，根据病情可增加至0.3 g，1日1次。

1.3实验仪器及试剂 TGL-18R冷冻离心机（黑马仪器公司）；DYY-6B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；普通PCR仪（美国ABI公司，型号ABI2720）；荧光定量PCR仪（美国ABI公司，型号ABI7500）。

逆转录试剂盒（Fermentas公司，批号00058391）；Trizol Reagent（Invitrogen公司，批号97752639）；引物及探针合成（Invitrogen公司，批号96715982）；DEPC（Ruibio公司，批号20130527）；荧光定量试剂及实验耗材（TaKaRa公司）。

2　实验方法

2.1造模 适应性饲喂1周后禁食12 h，将链脲佐菌素（STZ）溶于柠檬酸缓冲液（pH 4.8），除空白对照组外，各模型组大鼠腹腔注射STZ（50 mg/kg）制备糖尿病肾病模型。给药后72 h尾静脉取血，应用血糖仪检测模型大鼠空腹血糖值（fasting blood glucose，FBG），血糖值大于16.7 mmol/L、伴有尿量增多、饮食增多者为糖尿病肾病造模成功。

2.2分组及给药 120只成年的糖尿病肾病大鼠（即60只雌性大鼠和60只雄性大鼠），雌雄各半，随机分为6组，每组20只（包括10只雄性大鼠和10只雌性大鼠），分别为：苁归益肾胶囊高、中、低剂量组；厄贝沙坦阳性对照组；模型组；正常组。每组大鼠用苦味酸溶液按照头、背、尾、四肢等相应部位做好标记。

按照人和大鼠间体表面积折算的等效剂量比值（0.018）计算大鼠给药量，最终确定苁归益肾胶囊高剂量组0.258 2 g/（100 g·d），苁归益肾胶囊中剂量组0.129 6 g/（100 g·d），苁归益肾胶囊低剂量组0.064 8 g/（100 g·d），厄贝沙坦阳性对照组0.001 35 g/（100 g·d），正常组给以等剂量的蒸馏水。采用灌胃给药的方法，每日灌胃1次，连续给药4周。

2.3标本采集 实验结束前1 d，用代谢笼收集与计量模型大鼠24 h尿量。药物干预结束后用5%水合氯醛溶液0.7 mL/100 g腹腔注射（ip）麻醉，待4～5 min大鼠被麻醉后，称定质量，腹腔主动脉取血，分离血清，-70℃保存备用；取肾脏，去包膜擦洗后精密电子天平称定质量，并取右肾放于冻存管中，置于液氮罐中冻存备用。

2.4观察指标 （1）取24 h尿液测24 h尿蛋白量；（2）取血清测定大鼠空腹血糖（FBG）；（3）大鼠血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）的水平；（4）测定血管紧张素Ⅱ受体结合蛋白（AGTRAP），结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF），肾组织血管紧张素Ⅱ受体1（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）的表达。

2.5检测方法

2.5.1测定大鼠24 h尿微蛋白量 取适量模型大鼠尿液于离心机3 000 r/min离心5 min，取上清液，应用蛋白分析仪检测模型大鼠24 h尿微蛋白量，由我院检验中心代测。

2.5.2检测大鼠空腹血糖（FBG） 采用HITACHI 7600-P1模块全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖（FBG）水平，由我院检验中心代测。

2.5.3测定大鼠肾脏AngⅡ的水平 采用ELISA法测定模型大鼠肾脏AngⅡ的水平，由安徽中医药大学实验中心代测。

2.5.4检测模型大鼠肾组织CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表达 应用RT-PCR法检测大鼠肾组织CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表达变化，由安徽中医药大学实验中心代测。

2.6统计学方法 运用SPSS 17.0软件分析数据，结果以±s表示，两组间运用单因素方差法进行分析。

3　实验结果

3.1大鼠空腹血糖（FBG）、24 h尿微蛋白量 与模型组相比，正常组大鼠空腹血糖24 h尿微蛋白低于模型组大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白量，具有统计学意义（P＜0.01）；各给药组大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白均低于模型组大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白，具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

与阳性药组相比，模型组大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白均显著偏高，具有统计学意义（P＜0.01）；低剂量组大鼠24 h尿微蛋白高于阳性药组大鼠24 h尿微蛋白量，有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠FBG、24 h尿微蛋白的影响（±s）Tab.1 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats FBG and 24 h urine m icro p rotein（±s）

表1　苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠FBG、24 h尿微蛋白的影响（±s）Tab.1 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats FBG and 24 h urine m icro p rotein（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性药组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别动物数/只FBG/（mmol·L-1）24 h尿微蛋白/（mg/24 h）正常组10 10.702±0.815**15.109±3.199**模型组8 26.960±5.985△△41.983±8.891△△低剂量组9 15.565±5.212**27.274±6.134**△中剂量组10 12.808±5.317**25.526±8.815**高剂量组9 11.385±2.666**23.751±5.522**阳性药组10 11.201±8.412**22.126±2.378**

3.2大鼠肾脏AngⅡ的水平 与模型组相比，苁归高剂量组、正常组大鼠肾脏AngⅡ的水平偏低，具有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，阳性药组大鼠肾脏AngⅡ的水平明显偏低，具有显著的统计学意义（P＜0.01）。见表2。

与阳性药组相比，苁归高剂量组、正常组大鼠肾脏AngⅡ的水平偏高，有统计学意义（P＜0.05），苁归中剂量组、苁归低剂量组、模型组大鼠肾脏AngⅡ的水平明显偏高，有显著的统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2　苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠肾脏AngⅡ的影响（±s）Tab.2 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats AngⅡ（±s）

表2　苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠肾脏AngⅡ的影响（±s）Tab.2 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats AngⅡ（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性药组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别动物数/只AngⅡ/（ng·L-1）正常组10 94.487±10.327△*模型组8 110.304±13.721△△低剂量组9 102.609±15.345△△中剂量组10 100.484±15.288△△高剂量组9 96.006±18.248△*阳性药组10 80.157±15.019**

3.3RT-PCR检测大鼠肾组织CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R的表达 利用实时荧光定量仪（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System）定量分析以上指标，所测Ct值见表3。

本次实验所使用的分析方法为：相对定量研究（relative quantification study）。分析所采用的指标为：2-ΔΔCt，即由Ct值得出各组相对定量值（Relative Quantification，RQ）后（RQ=2-ΔΔCt），在计算机上得出如下各分析图谱，即柱状图1～3所示。

表3　苁归益肾胶囊对模型大鼠肾脏CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表达影响（Ct值，±s）Tab.3 Im pact of Conggui Yishen Capsules of rat kidney AT1R，AGTRAP and CTGF（Ct，±s）

表3　苁归益肾胶囊对模型大鼠肾脏CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表达影响（Ct值，±s）Tab.3 Im pact of Conggui Yishen Capsules of rat kidney AT1R，AGTRAP and CTGF（Ct，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性药组比较，△P＜0.05

组 别CTGFmRNA AGTRAP AT1R正常组20.116±0.198 22.126±0.979**26.151±0.595*△模型组20.894±0.183 17.108±0.592 19.957±0.411低剂量组20.132±0.209 18.967±0.794 22.187±0.503中剂量组20.769±0.313*△18.870±1.823 20.986±0.357高剂量组20.326±0.197*18.056±0.537△22.243±0.671△阳性药组19.851±0.279 18.959±0.938 20.787±0.287

4　讨论

糖尿病肾病是糖尿病的微血管并发症之一，亦称糖尿病性肾小球硬化症，随着糖尿病患病率的日趋增加，糖尿病肾病患病率亦随之增加。近年来，中医药在防治糖尿病肾病的发生、发展及延缓肾功能恶化等方面显示出显著的优势［1］，各代医家分别从脾虚论、肾虚论、脾肾两虚论、水湿痰浊毒邪论、瘀血论、络病学［2］等方面对其可能中医病机进行了阐述。

4.1空腹血糖与糖尿病肾病 高血糖是糖尿病最常见的症状之一，而且血糖值的高低也可以作为反映糖尿病的一个参考指标［3］。空腹血糖反映胰岛β细胞的生理功能，也是糖尿病最常用的检测指标之一，反映基础胰岛素的分泌功能。神经系统和激素可调节血糖浓度使其保持相对稳定［4］。当调节失去平衡后，则会出现低血糖或高血糖。

图1　RT-PCR检测大鼠肾组织AT1R的相对定量值（RQ值）Fig.1 Rat kidney tissue relative quantitative value of AT1R w ith Real time-PCR（RQ）

图2　Real time-PCR检测大鼠肾组织AGTRAP的相对定量值（RQ值）Fig.2 Rat kidney tissue relative quantitative value of AGTRAP w ith Real time-PCR（RQ）

图3　Real time-PCR检测大鼠肾组织CTGF的相对定量值（RQ值）Fig.3 Rat kidney tissue relative quantitative value of CTGF w ith Real time-PCR（RQ）

研究表明，苁归益肾胶囊不同剂量给药组大鼠血糖浓度低于模型组大鼠血糖值，与阳性药组无显著性差异，且随剂量而有所变化，结果显示苁归益肾胶囊具有降低糖尿病肾病模型大鼠血糖之作用，进而对糖尿病肾病模型大鼠呈现一定治疗作用。

4.2尿微蛋白与糖尿病肾病 糖尿病肾病另一主要表现形式为产生蛋白尿。在糖尿病肾病初期表现为微量白蛋白尿，此为早期糖尿病肾病主要特点，可预测糖尿病肾病发生的发展，且与预后亦有关联。随病情进展，尿蛋白排量逐渐增加，尿蛋白量值为临床诊断糖尿病肾病重要指标，同时反映并预示糖尿病患者病情发展阶段［5］。

本研究结果显示，苁归益肾胶囊给药组24 h尿蛋白量低于糖尿病肾病模型组大鼠24 h尿蛋白量，且与阳性药组无显著性差异，说明苁归益肾胶囊对糖尿病肾病模型大鼠具有一定的治疗效果。

4.3AngⅡ与糖尿病肾病 AngⅡ是AngⅠ在转化酶作用下的水解产物，AngⅡ是血管紧张素的重要组成部分［6-7］。人体的肾上腺皮质球状带细胞、血管平滑肌、脑、肾和心脏上的细胞存在有血管紧张素受体。血管紧张素受体与AngⅡ结合，产生部分生理效应；AngⅡ作用于血管平滑肌，可使全身微动脉收缩，动脉血压升高，是目前已知最强的缩血管活性物质之一。研究表明，糖尿病患者在出现肾病之前，血压呈现上升态势，而高血压亦能加速肾病之发展，合并高血压患者常在短时间内即可呈现肾衰竭症状。故有效的降压治疗可显著延缓糖尿病肾病的发展［8］。

本实验结果显示模型组大鼠AngⅡ水平高于空白组大鼠，苁归益肾高剂量组大鼠AngⅡ水平明显低于模型组，苁归益肾中剂量组和低剂量组大鼠AngⅡ水平与模型组大鼠无显著性差异，表明苁归益肾胶囊具有降低糖尿病肾病模型大鼠AngⅡ水平的作用，进而降血压，延缓糖尿病肾病的发展，延长患者生命。其疗效与用药剂量有关，这可能是苁归益肾胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制之一。

4.4AT1R与糖尿病肾病 AngⅡ的主要受体为AT1R［9-10］，于肾脏内广泛存在，AT1R介导AngⅡ对组织的效应，其表达变化调节AngⅡ生物学效应，反应出肾素-血管紧张素-醛固酮系统的生物学活性水平［11］。

本实验研究结果表明，苁归益肾胶囊不同剂量给药组大鼠AT1R和AngⅡ较模型组显著降低，显示苁归益肾胶囊可能具有作用于AngⅡ受体，进而降低血压的作用。其机制可能为苁归益肾胶囊抑制AngⅡ和AT1R结合，使主动脉局部AngⅡ作用减弱，降低血管AT1R的表达上调。

4.5AGTRAP与糖尿病肾病 AGTRAP是存在于AngⅡ的作用靶点上的一类特殊蛋白质［12-13］，对AngⅡ具有特异性识别功能并与之结合产生升血压的作用［14］。本研究表明，苁归益肾胶囊高、中剂量组大鼠AGTRAP表达与模型组相比显著降低，显示苁归益肾胶囊可抑制AGTRAP的表达、部分阻断AngⅡ与其结合、实现降低血压、进而实现治疗糖尿病肾病之目的。

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Preventive effects of Conggui Yishen Capsules on the diabetic nephropathy rats

DUAN Xian-chun， WANG Yong-zhong， FANG Zhao-hui*， WU Jian， GAO Jia-rong， LUO Huan，XIA Lun-zhu
（The First Affiliated Hospital of AnhuiUniυersity of ChineseMedicine，Grade Three Laboratory of Traditional ChineseMedicine Preparation，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Hefei230031，China）

AIM To study the protective effects of Conggui Yishen Capsules（Cistanches Herba，Angelicae sinensis Radix，Corni Fructus，Cinnamomi Ramulus，Alismatis Rhizoma，Moutan Cortex）on kidney of rat with diabetic nephropathy（DN）.METHODS One hundred and twenty SD rats were randomly divided into six groups，including normal control group，themodel group，Irbesartan groups，Conggui Yishen Capsules high-，medium-，and low-dosage groups.The DN modelwas prepared by intraperitoneal injection of STZ.The 24 h urinary protein，FBG，and the expression of AngⅡ，AT1R，AGTRAP，and CTGF weremeasured four weeks later.RESULTS After treatment，24 h urine protein，FBG，and AngⅡin three Conggui Yishen Capsules groupswere significantly lower than those of themodel group（P＜0.05）.CONCLUSION Conggui Yishen Capsules have therapeutic effects on DN rats.Themechanism may be related to down-regulation of AT1R，AGTRAP，CTGF and reduced amount of AngⅡ.

Conggui Yishen Capsules；diabetic nephropathy（DN）；angiotensinⅡ（AngⅡ）；angiotensinⅡtype 1 receptor（AT1R）；angiotensinⅡrecepter protein（AGTRAP）；connective tissue growth factor（CTGF）；rat

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0473-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.002

2014-01-15

国家中医临床研究基地重点病种糖尿病专项基金项目（JDZX2012001）；安徽省中医发展省级专项补助资金项目（卫中医药秘【2014】342号，2014ZYZJ02）；国家中医药管理局重点学科内分泌学学科开发基金项目（2011nfmxk011、2011nfmxk012）；安徽高校省级自然科学研究（重点）项目（KJ2013A169）；安徽中医学院临床科学研究基金项目（2010LC-003A）；国家中医药重点学科临床中药学建设项目（国中医人教发【2012】32号）

段贤春（1981—），男，硕士，主管药师，从事中药新药研发与中药神经药理学研究。Tel：（0551）62838702，E-mail：dxcflying2008@163.com

方朝晖，教授，主任医师，从事中医药防治代谢内分泌疾病的临床研究。Tel：（0551）62850092，E-mail：fangzhaohui9097@163.com