降糖宁胶囊对HepG2细胞糖代谢作用及其作用机制的研究

赵清辉， 王 琳， 陈慧芳， 谢欣梅， 庞晓斌

（河南大学药物研究所，河南　开封　475004）

降糖宁胶囊对HepG2细胞糖代谢作用及其作用机制的研究

赵清辉， 王 琳， 陈慧芳， 谢欣梅， 庞晓斌*

（河南大学药物研究所，河南开封475004）

目的 观察降糖宁胶囊（人参、山药、石膏、知母等）对HepG2细胞糖代谢的影响，并探讨其降糖机制。方法 体外培养人肝癌HepG2细胞，MTT法检测降糖宁对细胞活力的影响；HE染色法观察降糖宁对细胞形态的影响；采用葡萄糖氧化酶法检测降糖宁对细胞糖消耗的影响；Western-blot检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及人胰岛素受体底物（IRS1）表达量。结果 降糖宁胶囊对HepG2细胞的活力和形态无明显影响，可明显促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗，能促进AMPKβ1/2、IRS1蛋白表达量。结论 降糖宁胶囊的降糖机制可能涉及对胰岛素受体信号通路及AMPK信号通路的影响。

降糖宁胶囊；HepG2；糖代谢；AMPK；IRS1

随着世界经济的发展，糖尿病发病率逐年上升。目前全世界至少有1.71亿人罹患糖尿病，到2030年患病人数可能倍增达3.66亿人，而我国的糖尿病患者现已达4 000多万［1］。如果不控制血糖水平，继发的心血管事件将最终成为糖尿病患者致死、致残的最主要原因。目前临床应用的降糖药主要有双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素及其类似物。但是这些药物都会有一定的不良反应和不足之处［2］。临床实验表明中药在治疗糖尿病方面发挥着独特的作用，并且不良反应相对较低，降糖作用温和持久［3-5］。

降糖宁胶囊由人参、山药、生石膏、知母、黄芪、天花粉、茯苓、麦冬、生地黄、地骨皮、玉米须、山茱萸、甘草组成，具有降糖降脂，增强Ⅱ型糖尿病人的耐糖能力和增加肝糖原的量、改善脂代谢的作用［6］。现代药理学研究证明其中的有效成分具有降血糖、抗氧化、抗焦虑，抗疲劳等多种药理作用［7-8］。动物实验表明，降糖宁胶囊对于四氧嘧啶引起的糖尿病大鼠有良好的疗效。本实验通过观察降糖宁胶囊对HepG2细胞的作用，探索其体外降糖作用及其降糖机制。

1　材料

1.1药品与试剂 人肝癌HepG2细胞由本实验室保存。降糖宁胶囊（吉林天强制药有限公司，国药准字Z20054733）。DMEM培养基（Gibico公司）；小牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；葡萄糖测定试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司）；噻唑蓝（MTT）、罗格列酮、牛胰岛素（美国Sigma公司）；BCA法蛋白浓度测定试剂盒（北京平原皓生物技术有限公司）；兔AMPKβ1/2、IRS1、β-actin多克隆抗体，荧光标记二抗（美国Cell Signal公司）。

1.2仪器 超净工作台（SW-CJ-2FD苏州净化设备有限公司）；二氧化碳培养箱（3432 Thermo Fisher Scientific）；倒置显微镜（ECLIPSE TS100-F NIKON）；酶标仪（SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH）；凝胶成像系统（JYO4S-3B北京君意东方电泳设备有限公司）。

2　方法

2.1药物处理 取降糖宁胶囊0.4 g溶于10 mL DMSO中过夜，在洁净工作台里，分别用0.44μm和0.22μm的滤器过滤，再用DMEM培养基稀释成不同质量浓度的药液备用。

2.2细胞培养 人肝癌细胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基在37℃，5%CO2的培养箱中培养。

2.3MTT法测定细胞活力 取对数生长期HepG2细胞，调节密度为6×103个/孔，接种于96孔细胞培养板，在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养至细胞融合度达到80%时，更换DMEM培养基，并于每孔加入不同质量浓度的降糖宁，使其终质量浓度分别为1×10-5、1×10-4、1×10-3、1× 10-2、1×10-1、1、10、100 mg/L。并设空白调零孔（只加DMEM培养基，不加细胞）。每组均设3个复孔，培养48 h，每孔加入5 mg/mLMTT 10μL，37℃继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪检测各孔在490 nm波长下的吸光度（OD）值。吸光度值高低反映细胞的活力。

2.4细胞形态的观察 将盖玻片放入6孔板中，1×10-3mg/L降糖宁药物作用36 h后取出盖玻片，PBS洗两遍，95%乙醇固定20 min，PBS洗两遍，木素染液染核3 min，自来水洗涤，镜检，浸入伊红染液染色1 min，自来水洗涤，镜检拍照。

2.5葡萄糖氧化酶法检测细胞葡萄糖消耗量 取对数生长期的HepG2细胞，以6×103个/孔接种在96孔板。实验分为空白组、对照组、降糖宁组、胰岛素组（3×10-7mol/L）及罗格列酮组（3× 10-5mol/L）。降糖宁的终质量浓度分别为1× 10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mg/L。每组设3个复孔。加药24、36、48 h后以葡萄糖氧化酶法检测培养液上清液中的葡萄糖量。以未接种细胞的空白组的葡萄糖量均值减去各组测得的培养液中葡萄糖量即得各孔细胞的葡萄糖消耗量。

2.6Western-blot法检测AMPKβ1/2、IRS1蛋白的表达 取对数生长期的HepG2细胞，以6×103个/孔接种在96孔板。实验分为对照组、降糖宁组（1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/L）、罗格列酮组（3×10-5mol/L）。培养24 h，收集相应处理后的各组细胞，用预冷的Western细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白。配置10%分离胶和浓缩胶，取30 μg蛋白加入上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭，分别加入AMPKβ1/2（1∶1 000）、IRS1（1∶1 000）一抗4℃孵育过夜，TBST洗5遍，二抗（1∶2 000）孵育2 h，TBST洗5遍，通过ECL试剂盒进行显影检测。结果采用凝胶成像系统软件进行灰度值分析。

3　实验结果

3.1降糖宁对HepG2细胞活力的影响 实验结果显示，与对照组相比，1×10-5～100 mg/L范围的降糖宁胶囊对HepG2细胞的活力均没有明显影响（P＞0.05）。见图1。

3.2降糖宁对HepG2细胞形态的影响 实验结果显示，在1×10-3mg/L降糖宁胶囊对HepG2作用36 h后，光镜下HE染色观察可见HepG2细胞质红染，细胞核蓝染。核大，多核，核质比例失调呈典型肿瘤细胞形态特征。空白组与加药组相比较，未见明显差异。见图2。

3.3降糖宁胶囊对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

与对照组相比，降糖宁胶囊作用于细胞后均可增加细胞的糖消耗。24 h糖消耗增加率为19.71%～40.89%，36 h糖消耗率增加为24.01%～42.15%，48 h糖消耗率增加为6.96%～16.12%。结果显示，各组糖消耗在36 h时最高，降糖宁的最大有效质量浓度为1×10-3mg/L，糖消耗量高于各时间胰岛素组和罗格列酮组。见表1。

图1　降糖宁对HepG2细胞活力的影响（n=3，±s）Fig.1 Effect of Jangtangning Capsules on cell viability in HepG2（n=3，±s）

图2　HepG2细胞HE染色结果（×400）Fig.2 HE stained graph of HepG2 cells in control and test groups（×400）

表1　降糖宁对HepG2细胞糖消耗的影响（n=3，±s）Tab.1 Effect of Jiangtangning Capsules on glucose consumption in HepG2 cell（n=3，±s）

表1　降糖宁对HepG2细胞糖消耗的影响（n=3，±s）Tab.1 Effect of Jiangtangning Capsules on glucose consumption in HepG2 cell（n=3，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量葡萄糖消耗/（mmol·L-1）24 h 36 h 48 h对照组0 2.042±0.287 2.771±0.207 5.002±0.328胰岛素组3×10-7mol/L 2.668±0.614*3.450±0.206*5.230±0.305罗格列酮3×10-5mol/L 2.701±0.402*3.610±0.389*5.539±0.411降糖宁组1×10-6mg/L 2.444±0.126*3.436±0.227**5.348±0.337降糖宁组1×10-5mg/L 2.682±0.131*3.688±0.134**5.412±0.137降糖宁组1×10-4mg/L 2.659±0.117*3.668±0.158**5.475±0.192降糖宁组1×10-3mg/L 2.877±0.049*3.939±0.102**5.806±0.064*降糖宁组1×10-2mg/L 2.812±0.099*3.831±0.137**5.596±0.130*降糖宁组1×10-1mg/L 2.792±0.015*3.765±0.227**5.777±0.193*

3.4降糖宁对HepG2细胞IRS1蛋白表达的影响

与对照组相比，经降糖宁作用后，HepG2细胞IRS1蛋白表达量明显提高（P＜0.05），并且不同质量浓度的降糖宁胶囊呈剂量依赖性的增加IRS-1蛋白表达量。见图3。

图3　降糖宁对HepG2细胞IRS1蛋白表达的影响（n= 3，±s）Fig.3 Effect of Jangtangning Capsules on the expression of IRS1in HepG2 cells（n=3，±s）

3.5降糖宁对HepG2细胞AMPKβ1/2蛋白表达的影响 与对照组相比，经降糖宁作用后，HepG2细胞中AMPKβ1/2蛋白表达量明显提高（P＜0.05），并呈剂量依赖关系。1×10-3μg/mL组蛋白表达量比罗格列酮略高。见图4。

图4　降糖宁对HepG2细胞AMPKβ1/2蛋白表达的影响（n=3，±s）Fig.4 Effect of Jangtangning Capsules on the expression of AMPKβ1/2 in HepG2 cells（n=3，±s）

4　讨论

糖尿病是一种常见的内分泌系统疾病，是由于体内胰岛素的绝对缺乏或相对不足，或其他原因造成其不能发挥正常生理作用，而引起的以糖代谢紊乱为主的一种代谢混乱综合病症。高血糖是其主要特征，常用降糖药物有化学药、胰岛素类、中药等，中医药在治疗糖尿病方面表现出独特的优越性。降糖宁胶囊是临床常用中成药，降糖效果显著，但降糖机制研究较少。本研究通过体外培养细胞探讨降糖宁的作用机制。实验结果表明，降糖宁对细胞形态及活力无明显影响，说明降糖宁对人肝癌HepG2细胞无明显毒性。

葡萄糖消耗实验是评价药物是否具有降糖作用的常用体外方法之一［9］，常用的细胞系有HepG2人肝癌细胞、3T3-L1小鼠脂肪细胞、L6大鼠骨骼肌细胞［10-11］。本实验选用人肝癌HepG2细胞进行葡萄糖消耗实验。实验结果显示降糖宁胶囊可明显促进HepG2细胞糖消耗，在1×10-6～1×10-1mg/L范围内均有很好的降糖作用，最大有效质量浓度为1×10-3mg/L。

胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）是参与胰岛素及其他细胞因子信号转导的磷酸化蛋白，其家族目前已发现有4个成员IRS1～IRS4［12］。胰岛素受体（IR）与IRS结合后，使其自身及IRS磷酸化，磷酸化了的IRS与多种含SH2结构域的蛋白质结合，并使之激活，进而促进葡萄糖转运体（GLUT）的合成，启动细胞对葡萄糖的摄取［13］。本研究结果表明1×10-5～1×10-3mg/L范围内的降糖宁胶囊均能增加细胞IRS1蛋白表达量，并且呈剂量依赖性关系。说明降糖宁的降糖作用与胰岛素信号转导通路中胰岛素受体底物的表达增加有关。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activate protein kinas，AMPK），是由起催化作用的α亚基和起调节作用的β亚基与γ亚基组成的异三聚体［14］。AMPK作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程，其活性受AMP/ATP比值调控，被称为细胞的“代谢感受器”［15-16］。研究发现，多种降糖药，如改善胰岛素抵抗的二甲双胍、噻唑烷二酮类和α-硫辛酸等均可以激活AMPK，此外，苦瓜提取物、白藜芦醇、小檗碱、多酚类、三萜类等天然药物也被发现能够激活AMPK［17-18］。研究表明，AMPK的作用主要有：增加葡萄糖转运体4（GLUT4）基因的表达和转位以增强外周组织对葡萄糖的摄取；调控糖脂代谢的基因表达；AMPK的激活可以促进过氧化物酶增殖激活物受体（PPAR-γcoactivator 1α，PGC-1α）的表达及活化。PGC-1α表达增加，通过促进线粒体再生，改善糖脂代谢紊乱和线粒体呼吸功能，从而改善胰岛素抵抗［19］。本研究结果表明1×10-5～1×10-3mg/L质量浓度的降糖宁胶囊均可提高AMPKβ1/2蛋白的表达量，提示AMPK信号通路可能是降糖宁发挥降糖作用的机制之一。

本实验中IRS1与AMPK蛋白水平均有增加的趋势，提示降糖宁胶囊促进细胞葡萄糖消耗可能是通过增加细胞内IRS的磷酸化水平，影响胰岛素信号的下游转导，同时激活AMPK，改善胰岛素抵抗，从而起到增加细胞葡糖糖的消耗，达到降糖作用。

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Glucometabolism of Jiangtangning Capsules on HepG2 cells and itsmechanism

ZHAO Qing-hui， WANG Lin， CHEN Hui-fang， XIE Xin-mei， PANG Xiao-bin*
（Institute of Pharmacy，Henan Uniυersity，Kaifeng 475004，China）

AIM To explore the effect of Jiangtangning Capsules（Ginseng Radix et Rhizoma，Dioscoreae Rhizoma，Gypsum Fibrosum，Anemarrhenae Rhizoma，etc.）on glucose metabolism of HepG2 cells inυitro and its mechanism.METHODS MTT assay was used tomeasure the viability of the HepG2 cells.HE stainingwas used for the observation of themorphological changes in HepG2 cells under the influence of Jiangtangning Capsules and glucose consumption was detected by oxidation enzyme method.The AMP-activated protein kinase（AMPK）and IRS-activated protein kinase（IRS1）were examined by Western-blot.RESULTS Jiangtangning Capsules could obviously promote the glucose consumption，AMPKβ1/2，and the IRS1 protein expression of the HepG2 cellswithout affecting its viability or causing morphological change.CONCLUSION The hypoglycemic mechanism of Jiangtangning Capsulesmay be associated with insulin receptor signaling pathways and AMPK pathway.

Jiangtangning Capsules；HepG2；glucometabolism；AMPK；IRS1

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0483-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.004

2014-05-16

国家自然科学基金（81273652）

赵清辉（1989—），男，硕士生，研究方向为药物筛选及评价。E-mail：1178968651@qq.com

庞晓斌（1973—），男，博士，副教授，研究方向为药物筛选。Tel：（0371）23880680，E-mail：hndxpxb@163.com